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目的:恶性胶质细胞瘤(GBM,世界卫生组织IV级神经胶质瘤)在成年人中它是最常见的恶性的原发性脑肿瘤,它是人类最致命的肿瘤之一。尽管在过去几十年的治疗中不断取得进展,但本病的治疗及预后仍然很差,在美国和欧洲地区5年生存率平均小于3%。最近的研究已经表明,在胶质瘤细胞中,存在着胶质瘤干细胞(CSCs),胶质瘤干细胞能自我分化并不断的更新增殖成胶质瘤细胞,并导致肿瘤不断增殖生长。本研究目的就是鉴于此理论基础,从恶性胶质细胞瘤中分离表达CD133的细胞,通过一系列实验证实其是高度致瘤性,并且有很强的侵袭性和耐化疗性。然而,对于维持胶质瘤干细胞的分子机制在很大程度上仍然未知。有实验报道,在维持肿瘤干细胞的干性上,发现miRNA起到一定的作用,miRNA是一类长度为19~25个核苷酸的非编码单链小RNA分子,参与基因转录后的调节,一般通过靶基因的3’端非翻译区部分互补配对的结合方法来调控目的基因转录水平。研究表明,Hippo信号通路起着限制器官大小和抑制肿瘤发生起至关重要的作用。生物学上表明,Hippo信号通路在很大程度上限制了它的两个下游效应因子YAP和TAZ。而基因MST1-SAV1的活性直接影响到YAP/TAZ的表达水平。在此,我们通过筛查出miR-130b在胶质瘤中的高表达水平,通过过表达miR-130b后来检测Hippo信号通路中的下游信号基因的表达及活性水平,同时检测干细胞标志基因,包括CD133、SOX2、Nanog、MYC和BMI1表达水平,以观察miR-130b对胶质瘤干细胞的影响。这些研究为miR-130b在Hippo信号通路中的作用,以及miR-130b在胶质细胞瘤的发展中的作用提供了一种新的机制,而且为胶质瘤的靶向治疗提供了一种很好的思路。方法:为了检测miR-130b在胶质瘤组织及细胞中表达水平,我们收集胶质瘤组织标本8例,正常组织3例。正常细胞NHA以及胶质瘤细胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG。运用BioTNT生物公司miR-130b检测试剂盒(CL-has-miR-130b)对标本进行检测。同时我们检测了miR-130b对胶质瘤增殖及胶质瘤干细胞成球的作用,将约500个细胞接种在6孔板上以及将约10个细胞接种在24孔板上,用无血清的培养基DMEM/F12培养13天,在培养的过种中加入2%B27,同时加入表皮生长因子20ng/ml,和bFGF 20ng/ml,0.4%牛血清白蛋白(BSA)和为5μg/ml的胰岛素。进行培养后,然后检测其成球的大小,算出其倍数。我们运用WB方法检测了miR-130b对Hippo信号通路中YAP、TAZ蛋白表达的影响,用核蛋白P84抗体作为参照(Sigma美国),同时检测MST1和SAV1蛋白水平,用α-Tubulin抗体作为内参对照(Sigma美国)。用荧光素酶方法检测mi R-130b对TEAD活性的影响,将购买的TEAD质粒在48孔板中共转染胶质瘤细胞,每组设置4个复孔,操作按照LipofectamineTM2000试剂说明书进行,48h后进行荧光素酶检测。运用mi RBASE软件预测miR-130b与MST1/SAV1的调控关系,软件预测miR-130b与MST1/SAV1都存在调控位点,运用荧光素酶的方法,检测miR-130b与基因MST1/SAV1是否存在调控作用,我们构建了MST1/SAV13’端,同时设计突变位点,共转染细胞进行上机检测,测定荧光值。结果:通过参考癌症基因GBM miRNA芯片数据(TCGA),我们发现miR-130b水平明显上调在人脑胶质瘤组织(n=496)与正常脑组织相比(n=10)(P<0.001)。通过RT-PCR检测进一步验证了这一结果。mi R-130b水平在8例GBM组织相比,与在3例正常脑组织中显著增加,并与在5种胶质细胞瘤的细胞系相比,在正常的人星形胶质细胞(NHA)显著降低。miR-130b对胶质瘤增殖及胶质瘤干细胞成球的作用,过表达miR-130b有力促进悬浮培养产生大约两倍以上的细胞球。相反,mir-130b-抑制细胞形成的球体不及正常球体的2倍,我们的研究结果表明,miR-130b促进胶质细胞瘤成球的作用。WB法检测蛋白的表达水平得知,过表达miR-130b使YAP、TAZ的表达增高,而抑制miR-130b的表达可以使蛋白YAP、TAZ的表达降低,而核因子P84的表达却没有影响,而过表达miR-130b后,MST1和SAV1蛋白水平降低,这说明miR-130b直接影响了Hippo信号通路基因而发挥相关功能作用。荧光素酶进一步验证了在过表达miR-130b的稳定细胞株SNB19和LN18中,干扰YAP和TAZ的情况下,与阳性对照的顺铂对比,检测的荧光值为1、0.25、0.28和1、0.26、0.39,均有统计学意义(P<0.001)。结论:YAP与TAZ均与TEAD有显著的作用,其降低TEAD的活性比顺铂还要强。由mirBASE软件预测miR-130b与MST1/SAV1有调控位点,通过荧光素酶检测提示mi R-130b与MST1/SAV1-3’UTR测得的荧光值显著降低,说明它们之间有结合点,减弱了荧光的表达,而在对照及正常组中,荧光的值没有什么变化,在抑制组中,荧光值增强,提示抑制剂阻止了与MST1/SAV1-3’UTR的结合,这些数据说明miR-130b与MST1/SAV1-3’UTR存在结合的调控位点,这与理论工具预测是一致的。所有的统计分析,进行了用SPSS统计软件。两个样本均数比较采用T进行检验;P值<0.05被认为是差异有显著意义。