黄芩苷及其酯类衍生物抗牛病毒性腹泻病毒及抑菌活性研究

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黄芩苷为中药黄芩(Scutellaria bailensis Georgi)的活性代表成分,其在抗病毒及抗菌方面的显著作用亦日益受到关注。牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV)可引起牛病毒性腹泻-粘膜病(Bovine Viral Diarrhea disease,BVD),在我国牛群中阳性检出率高达90.0%,死亡率高达50%,给养牛业造成巨大经济损失。本论文对黄芩苷及其酯类衍生物的抗BVDV及抑菌作用展开了科学研究。首先,通过免疫过氧化物酶实验(IPMA)考察了不同生物型BVDV的TCID50,确定TC株(NCP型)BVDV与NADL株(CP型)BVDV的TCID50分别为107.25/0.1mL、104.75/0.1mL;采用CCK-8法与CPE法相结合,确定了黄芩苷及其酯类衍生物对MDBK细胞的最大药物安全浓度。其次,我们进行了黄芩苷及其酯类衍生物体外抗NCP型BVDV与CP型BVDV活性研究。采用Taq Man荧光探针法,检测复制抑制、入侵阻断、直接杀伤、综合抑制四种不同作用方式下,NCP型BVDV RNA在MDBK细胞中的复制水平。结果显示,黄芩苷及其酯类衍生物抑制了NCP型BVDV RNA的复制,且不同药物同种药物处理方式抑制作用具有显著性差异,同种药物不同作用方式效果差异显著。同时,采用CCK-8法与CPE法相结合进行黄芩苷及其酯类衍生物的体外抗CP型BVDV活性研究。结果显示,四种不同的作用方式下,黄芩苷及其酯类衍生物在体外对CP型BVDV具有显著抑制活性。进而,以活性显著且化学性质稳定的黄芩苷、黄芩苷甲酯、黄芩苷乙酯为研究对象,采用筛选的最佳药物处理方式,应用流式细胞术进一步检测药物+病毒组,病毒组与对照组细胞凋亡情况;采用实时荧光定量PCR技术,运用SYBR GreenⅠ荧光染料法检测细胞自噬基因Beclin-1、ATG-14 mRNA的相对表达量;采用Western blot检测Beclin-1、ATG-14蛋白表达情况初步研究黄芩苷及其衍生物抗病毒机理。结果显示,分别给予黄芩苷、黄芩苷甲酯与黄芩苷乙酯+病毒的细胞与只给予病毒的细胞相比较,细胞凋亡明显减少。NCP型BVDV与CP型BVDV侵染细胞后自噬基因表达上升,黄芩苷、黄芩苷甲酯与黄芩苷乙酯降低了CP型与NCP型BVDV侵染细胞后的自噬基因Beclin-1、ATG-14 mRNA的表达,下调了Beclin-1、ATG-14蛋白的表达。最后,对黄芩苷及其酯类衍生物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性进行了评价。结果显示,黄芩苷及其酯类衍生物体外对6株菌均具有抑制作用。其中黄芩苷甲酯、黄芩苷乙酯、黄芩苷己酯与黄芩苷庚酯抑制甲型副伤寒沙门氏菌效果显著,MIC值均为0.625mg/mL,且低于黄芩苷MIC值(1.25mg/mL)。黄芩苷乙酯抑制鼠伤寒沙门氏菌作用(MIC=0.625mg/mL)强于黄芩苷(MIC=1.25mg/mL)。
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