研究背景缺血再灌注损伤(I/R)是指组织器官在缺血的基础上恢复血流供应以后，组织器官的损伤程度反而加重的现象。I/R普遍存在于临床各科的工作实践当中，尽管曾经有多种I/R的损伤学说被提出，例如：氧异常、钙异常、PH异常等等。但是，I/R完整的发病机制迄今为止尚未能得到完全的阐明。肾脏由于其独特的生理结构和功能特点，是极易受缺血缺氧刺激的影响的靶器官，从而常常因为I/R而发生急性肾损伤(Acutekidney injury，AKI)。AKI是涉及多个临床学科的常见急危重症，不仅在外科领域，如肾移植、肾脏手术、肾梗阻积水、肾动脉狭窄、栓塞性疾病等，而且在内科领域，如各种肾小球疾病的急性期，I/R导致的AKI都是不可避免的肾脏损伤之一。AKI的典型病理改变是急性肾小管坏死，所以目前认为肾小管上皮细胞的损伤在肾脏I/R的过程中居于关键地位。由于I/R发生发展的机制尚未能够完全阐明，导致目前临床上尚无有效的防治I/R的手段。所以，探讨肾脏I/R的机制已成为临床相关领域中的重大课题，而努力寻找到一种能够有效防治肾脏I/R的有效措施，将会产生重大的社会和经济效益。长久以来的传统观点认为：凋亡(apoptosis)是一种细胞自我调控的主动病理生理过程；而坏死(necrosis)则被认为是相对不可逆的细胞死亡过程，难以通过药理学途径的干预得到阻止或者说逆转。然而，目前的研究发现：在细胞坏死的大背景中，至少有相当部分的细胞坏死可以像凋亡那样，由特定的刺激信号启动，并且按照一定的信号传导通路和执行程序发生，具有精密的调控机制，并被命名为“necroptosis”(程序性坏死，又被译做坏死性凋亡)。necroptosis的发现和研究进展使得临床上对细胞坏死的过程进行调控成为可能，那就有可能将对生命科学的基础研究和临床相关疾病的治疗产生重要的影响。necroptosis已被证实存在于肾脏I/R中，并且研究者们发现是necroptosis的特异性抑制剂necrostatin-1而不是apoptosis的关键酶Caspase的阻滞剂zVAD能显著改善肾脏I/R动物模型的组织损害，这就提示我们：necroptosis在肾脏I/R中发挥了比apoptosis更为重要的作用，在I/R过程中阻断necroptosis是防治肾脏I/R的新方向。necroptosis的发生受到脱乙酰酶sirtuin-2的调控，这是因为sirtuin-2的脱乙酰化作用是necroptosis的关键信号分子受体相互作用蛋白1(receptor-interactingprotein1，RIP1)与受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein3，RIP3)直接互作作用的必要条件。而sirtuin-2的酶活性取决于它的辅因子NAD+的水平。而我们知道，NAD+活性的降低与细胞能量的缺乏和氧化应激反应有关，由此推断necroptosis也是受代谢因素调控的。众所周知，缺血缺氧和再灌注过程导致的代谢因素的变化在肾I/R的发生中扮演重要的角色：在肾脏缺血的急性期由于缺氧会发生NAD+水平的下降甚至耗竭，而再灌注以后NAD+水平将会得到迅速地补充。这就或许可以解释为何在缺血再灌注的过程中最初并没有广泛的细胞死亡，但在再灌注后却转而发生。我们推测这可能是因为：再灌注发生以后NAD+水平会获得快速地补充，使得sirtuin-2的酶活性升高，RIP1与RIP3的相互作用得到加强，损伤信号加速传递，从而促进了necroptosis的发生；同时，由于necroptosis总是伴发强烈的炎症反应，也将通过炎症因子激发的“瀑布效应”进一步导致细胞的损伤。如果能证实以上推断，就将为我们打开了一扇机会之窗：通过在再灌注开始前阻断细胞的necroptosis来阻止肾脏I/R。传统型瞬时性受体电位通道6(transient receptor potential cation channel，TRPC6)是属于传统型瞬时性受体电位通道(TRPC)家族的成员之一，是位于细胞膜上的非选择性的阳离子通道。TRPC6激活后主要功能是介导钙离子内流，并通过受钙离子调控的下游信号传导通路实现细胞外-内的信号转导。目前的研究证明，TRPC6具有促进中枢神经系统神经元细胞发育和生存的作用，且其表达与体内代谢因素调控的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)氧化酶和活性氧(ROS)的活性有关，并且在脑缺血、视网膜以及肺的缺血再灌注损伤中也发挥了重要的作用。TRPC6在人肾小管上皮细胞上表达，我们在前期的预实验中发现TRPC6在肾脏I/R模型中表达也是增加的，并能够上调和sirtuin-2具有相同底物NAD+的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)的水平。所以，根据目前的研究进展和预实验结果，在本研究中，我们从离子通道蛋白与肾脏I/R损伤的关系入手，拟探索TRPC6在肾脏I/R中调控necroptosis的作用及其机制，以便为肾脏I/R的防治提供新的思路和新的治疗靶点。材料和方法1、利用基因检测芯片检测Brown Norway (BN)大鼠、Sprague Dawley(SD)大鼠肾脏I/R模型差异基因，利用NCBI GEO数据库进行miRNA靶基因网络分析、蛋白网络模块分析，筛选出差异基因并预测其可能的作用。2、免疫荧光染色法测定TRPC6在HK-2细胞中的表达情况。3、按照文献方法，利用矿物油隔绝氧气，利用增加了钙、镁的PBS孵育阻断能量供应来创建HK-2细胞体外缺血再灌注损伤模型。4、利用RNAI技术筛选、扩增TRPC6低表达的HK-2细胞。5、利用AnnxinV-FITC/PI试剂盒，使用流式细胞仪检测HK-2细胞在体外缺血再灌注损伤过程中的坏死/凋亡比例。6、利用westernblot方法检测HK-2细胞TRPC6、RIP1、PARP-1、sirtuin-2、AIF的蛋白表达变化情况。7、利用切除左肾，动脉夹夹闭右肾动脉40min的方法建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤的动物模型。8、利用Olympus AU2700全自动生化分析仪检测大鼠血清血肌酐水平。9、利用肾组织病理HE染色观察缺血再灌注大鼠肾脏损伤的形态学变化，并进行肾小管坏死半定量评分。10、利用超敏二步法免疫组化检测试剂盒进行肾脏组织免疫组化染色，观察RIP1、RIP3、TRPC6、CaMKII、PARP-1在肾脏组织的表达变化。11、利用Western-blot检测肾脏组织TRPC6、PARP-1、RIP1、sirtuin-2蛋白表达变化情况。12、利用工具药：OAG、SKF96365、KN-93研究TRPC6通道以及CaMKII在信号传导中的作用。主要结果1、筛选出了包括TRPC6在内的23个共同表达差异表达基因，并进行了生物信息学分析，我们分别利用信息库对上调和下调差异表达基因进行了miRNA靶基因预测，并构建了预测的网络分析图。2、HK-2细胞表达TRPC6，并在细胞体外缺血再灌注损伤过程中表达明显增加。3、HK-2细胞体外缺血再灌注损伤模型中，细胞的死亡以坏死为主，且能被necrostatin-1抑制，说明在这一病理过程中存在necroptosis。4、采用RNAI下调TRPC6表达的HK-2细胞在体外缺血再灌注损伤模型中的细胞坏死率明显升高。5、TRPC6激动剂OAG干预可以使HK-2细胞在体外缺血再灌注损伤模型中的细胞坏死率明显下降，取得与necroptosis特异性抑制剂nec-1类似的效果；而TRPC6阻断剂SKF96365和CaMKII抑制剂KN-93干预，使得HK-2细胞在体外缺血再灌注损伤模型中的细胞坏死率明显升高。6、体外缺血再灌注损伤模型中，采用RNAI下调TRPC6表达的HK-2细胞的PARP-1的表达明显下调；sirtuin-2的表达未受TRPC6下调的影响；RIP1的表达在TRPC6下调后明显升高。7、体外缺血再灌注损伤模型中，OAG干预组的HK-2细胞的PARP-1表达升高，而SKF96365和KN-93组PARP-1表达下调；RIP1的表达变化与此相反：OAG组RIP1表达下调，而SKA96365和KN-93组PARP-1表达升高。8、在肾脏缺血再灌注大鼠模型中，TRPC6主要在肾小管上皮细胞表达，肾小球也有表达；再灌注后24、48h TRPC6的表达明显增多，第5天TRPC6的表达开始减少； PARP-1、RIP1、sirtuin-2的蛋白表达与TRPC6有类似的变化趋势。9、在肾脏缺血再灌注大鼠模型中，采用OAG干预的大鼠，血肌酐水平明显下降；而使用SKF96365、KN-93干预的大鼠，血肌酐水平与缺血再灌注组相比明显升高。10、使用OAG干预后，缺血再灌注大鼠组织PARP-1表达升高、RIP1表达降低；相反，使用SKF96365、KN-93干预后，缺血再灌注大鼠组织PARP-1表达下降，RIP1表达升高。结论1、利用基因检测芯片检测差异表达蛋白以及靶基因网络分析、蛋白网络模块分析，发现TRPC6是缺血再灌注损伤的差异基因之一并预测其可能在调控缺血再灌注损伤中发挥重要作用。2、在HK-2细胞的体外缺血再灌注损伤模型中，TRPC6表达明显增加，通过CaMKII上调PARP-1的表达，通过PARP-1与sirtuin-2的竞争作用调控necroptosis；采用RNAI技术下调TRPC6表达的HK-2细胞在体外缺血再灌注损伤模型中坏死率明显升高，PARP-1表达下降，sirtuin-2表达无明显变化，而RIP1表达也明显升高。3、在大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型中，TRPC6的表达也明显升高。TRPC6的激动剂OAG改善大鼠血肌酐水平；TRPC6阻断剂SKFG96365以及CaMKII抑制剂KN-93加重血肌酐升高水平。4、综上：我们认为TRPC6在缺血再灌注损伤激活后通过CaMKII介导钙信号传导，在NAD+存在的条件下，通过PARP-1/sirtuin-2的相互作用调控肾小管上皮细胞程序性坏死，可以显著改善肾脏I/R损伤。