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干旱和腌渍严重制约着农作物的生产和发展,也是导致地球荒漠化的主要原因,对世界范围内的作物的生长带来了巨大的影响。新疆是农业大省,农业用水占总用水量的90%以上,而新疆水资源短缺,用于农业的水资源有限,因此利用基因工程手段发现和分离干旱生境中优质、高效天然的抗旱相关基因、研究抗旱机理以获得抗旱新品种,无论对新疆干旱区的生态恢复,还是对抗旱作物品种的选育均具有重大的意义。 新疆地域辽阔,但是大部都被盐碱地占据,正因为有干旱、盐渍和低温的非生物胁迫环境,才孕育出许多适应逆境的特色生物资源。线果芥(Conringia planisiliqua L.)和大蒜芥(Sisybrium altissimum L.)就是在新疆大地上世代繁衍而生存下来的草本绿色植物,属十字花科类早春短命植物,对新疆的特殊环境表现出出色的适应性。 为了进一步研究大蒜芥和线果芥在干旱胁迫下的响应机理,本研究用同源克隆的方法获得了大蒜芥和线果芥HRD基因,构建植物表达载体转入烟草,通过土壤干旱实验和PEG-6000模拟干旱实验来验证转基因烟草的抗旱性,结果证实了这个基因属于AP2/EREBP类转录因子,具有AP2/EREBP转录因子的基本特性,在转基因烟草中的过量表达可以提高烟草抵抗干旱的能力。主要研究结果如下: 1.分别从新疆短命植物线果芥和大蒜芥中克隆得到了一条完整开放阅读框为564bp,编码187个氨基酸的HRD转录因子基因,命名为CpHRD和SaHRD。比对发现二者仅有3个位点氨基酸序列的差别,具有很高的同源性,应属于同源物种。与山嵛菜(Eutrema salsugineum)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)、荠菜(Capsella rubella)及拟南芥(Arabidopsis thaliana)核苷酸序列的同源性可达88%、87%、87%和86%。 2.生物信息学分析表明:CpHRD和SaHRD基因编码的蛋白质分子量约为20kDa,等电点分别为4.73、4.81,属于含信号肽的亲水性非跨膜稳定蛋白。蛋白二级结构包括2个β-折叠、5个α-螺旋和无规则卷曲,位于N端有2个反平行的β-折叠碱性亲水区。二者均只含有一个保守的AP2/EREBP功能结构域,位于第14-72氨基酸位点之间,据研究该结构域转录因子与植物的抗逆性密切相关。 3.构建了CpHRD和SaHRD基因的植物表达载体,并分别导入到烟草中,获得了转基因材料。对两种转基因烟草进行了干旱胁迫实验,测定了相关的生理指标,结果显示两种转基因烟草的抗旱能力均高于对照组,且转CpHRD基因烟草抗旱性优于转SaHRD基因烟草。 4.构建了CpHRD和SaHRD原核表达载体,对原核表达体系进行了优化,结果表明在25℃,0.05mmol/L IPTG浓度诱导4h时蛋白表达最佳。通过Western blotting进行鉴定证明表达的蛋白正是His-HRD融合蛋白。