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哺乳动物绒毛生长调控是一个非常复杂的过程,经历毛囊的发育、分化和绒毛生长等过程,这一过程受到许多功能基因和生长相关因子的调控。毛囊特异性表达外源功能基因促进绒毛生长,培育高产绒量转基因动物新品系是近年研究的热点之一。同时转基因动物的安全性问题也显得十分重要,如何删除用于筛选转基因细胞克隆的标记基因是解决安全性问题的关键。本研究从选择毛囊特异性启动子和条件性删除标记基因两方面入手,首先克隆毛囊特异性表达的人表皮角蛋白14启动子(]Hum keratin14promoter, K14p),然后构建pK14-DsRed2-1载体验证K14p的特异性。通过引入Cre/LoxP基因敲除系统构建毛囊特异性表达VEGF164的条件打靶载体pCDsRed2-K14VL,分别稳定转染绒山羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞,筛选稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞克隆,检测VEGF164基因在不同细胞中的表达量。最后获得毛囊特异性表达外源VEGF164及可通过Cre酶删除标记基因的核移植细胞供体。实验采用PCR技术克隆人表皮角蛋白14启动子,并进行启动子信息分析。以pDsRed2-1载体为基本骨架将K14启动子序列亚克隆到红色荧光蛋白表达元件DsRed上游,构建验证毛囊特异性载体pK14-DsRed2-1。通过融合PCR法,构建含有毛囊特异性启动子K14p和LoxP序列原件-K14p-VEGF164-K14PolyA-LoxP-CDsRed-的毛囊特异性表达VEGF164的条件打靶载体pCDsRed2-K14VL。打靶载体以lipofectamineTM2000介导转染内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,采用SYBR Green荧光实时定量检测VEGF164mRNA在两种细胞中的表达量,Western blot检测VEGF蛋白在两种细胞中的表达。结果表明克隆的人表皮角蛋白14(K14)启动子,长度为2274bp,与NCBI上报道的人表皮角蛋白14启动子序列(DQ343282.1)有99.5%的相似性。核苷酸序列中GC含量为56%,TATA位点位于2169bp,序列中CpG岛序列起始于2061bp终止于2265bp。构建的毛囊特异性表达VEGF164基因的条件打靶载体pCDsRed2-K14VL经测序验证构建正确,载体元件K14启动子,VEGF164基因,K14PolyA, CMV启动子,Loxp和红色荧光蛋白均按正确顺序连接。pCDsRed2-K14VL转染绒山羊胎儿成纤维细胞和皮肤成纤维细胞,分别筛选得到转基因细胞克隆,PCR检测显示外源载体序列整合到了细胞基因组中。RT-PCR和Western blot检测表明转染VEGF164基因的内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞中的VEGF164蛋白表达量和mRNA表达量与内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞相比均有明显增加。表明外源VEGF164基因在皮肤成纤维细胞中得到特异性表达。本研究正确克隆了人K14基因启动子并通过对比表达实验验证其具有毛囊特异性启动功能。成功构建条件性去除红色荧光蛋白和卡那霉素抗性基因的毛囊特异表达VEGF164的真核条件打靶载体。外源VEGF164基因在绒山羊皮肤成纤维细胞中特异性表达。在构建的载体中引入Cre/LoxP基因敲除系统,为删除子代转基因动物中的外源标记基因奠定了基础,为保障转基因产品的安全性提供了条件。