第一部分RIPK3mRNA在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中的表达及其与疾病预后的关系研究背景慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是指慢性肝病患者发生的肝功能的急剧恶化。在亚洲,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是导致慢加急性肝衰竭的主要原因。慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)占慢加急性肝衰竭的 70%以上。慢加急性乙型肝炎肝衰竭通常进展迅速,在4周之内出现多器官功能衰竭。既往的研究发现,慢加急性乙型肝炎肝衰竭的早期和中期死亡率大约是50-90%,每年可导致超过12万的患者死亡。慢加急肝衰竭死亡率高,预后差,临床上一部分病人经过积极的内科综合治疗得到控制,但仍有相当一部分患者最后死亡。因而,在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中,迫切需要一种生物标记物能够预测发现死亡率高的患者,对这些患者加强监护,积极治疗,以降低死亡率。既往研究显示,坏死性凋亡在病毒防御和炎症性疾病中起着重要作用。坏死性凋亡与重症肝病的发病机制及进展密切相关。受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)为参与坏死性凋亡的过程的重要蛋白。研究目的本研究主要通过检测慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中RIPK3 mRNA的表达水平,并采集各项临床及预后相关指标,明确外周血PBMCs中RIPK3 mRNA水平与慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者病情严重程度及预后的关系,以阐明坏死性凋亡在慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的作用。研究方法我们回顾性分析了 122例慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者,131例慢性乙型肝炎(chronichepatitis B,CHB)患者和 35 例健康对照者(healthy controls,HCs)。入选的患者均来自2014年7月至2015年11月在山东大学齐鲁医院肝病科病房住院的患者。健康对照者为年龄、性别相匹配的健康志愿者。采集各研究对象清晨空腹外周静脉血,采用密度梯度离心分离法提取外周血PBMCs。利用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR),我们检测了患者外周血单个核细胞中的RIPK3 mRNA水平。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和半胱氨酸蛋白酶8(caspase 8)的水平。记录以上研究对象的年龄、性别等指标,收集肝功、肾功、凝血功能、HBV-DNA定量等临床指标并进行比较。包括谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST),总胆红素(total bilirubin,TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)、凝血酶原活动度(prothrombin activity,PTA)、国际标准化比率(international normalized ratio,INR)和肌酐(creatinine,Cr)等。终末期肝病模型(model for end-stage liver diseases,MELD)通过公式计算得出。慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者追踪随访3个月。统计患者随访3个月后的预后状况。所有统计学处理采用统计软件SPSS 19.0版本分析。P<0.05定为差异有统计学意义。研究结果1、慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血PBMCs中的RIPK3 mRNA水平明显高于慢性乙型肝炎患者(P<0.001)和健康对照者(P<0.001)。同时,慢性乙型肝炎患者的RIPK3 mRNA水平明显高于健康对照者(P<0.001)。2、RIPK3 mRNA水平和TBIL(r=0.377,P<0.001),Cr(r=0.214,P<0.05),INR(r=0.364,P<0.001),MELD积分(r=0.406,P<0.001)呈明显正相关。3、慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中合并有肝硬化、肝性脑病或者腹水患者的RIPK3水平明显高于没有合并症的患者(P<0.05)。4、慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清TNF-α水平明显高于慢性乙型肝炎患者(P<0.001)和健康对照者(P<0.001)。慢性乙型肝炎患者和健康对照者之间无显著性差异(P=0.058)。慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清MLKL水平明显高于慢性乙型肝炎患者(P<0.001)和健康对照者(P<0.001)。同时,慢性乙型肝炎患者血清MLKL水平明显高于健康对照者(P<0.001)。此外,慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中的caspase-8水平明显低于慢性乙型肝炎患者(P<0.001)和健康对照者(P<0.001)。慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者的RIPK3 mRNA水平与TNF-α水平(r=0.412,P<0.001)及MLKL水平(r=0.625,P<0.001)呈正相关。而RIPK3 mRNA水平与caspase-8呈负相关(r=-0.279,P<0.05)。5、单因素分析显示,慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者预后与TBIL(OR=1.007,95%CI:1.004-1.010,P<0.05),INR(OR=4.269,95%CI:2.254-8.086,P<0.05),PTA(OR=0.865,95%CI:0.811-0.922,P<0.05),腹水(OR=2.775,95%CI:1.329-5.795,P<0.05),肝硬化(OR=2.445,95%CI:1.175-5.087,P<0.05),肝性脑病(OR=4.740,95%CI:2.065-10.877,P<0.05),RIPK3 mRNA 水平(OR=1.106,95%CI:1.063-1.151,P<0.05),MELD积分(OR=1.207,95%CI:1.110-1.312,P<0.05)明显相关。多因素分析显示,RIPK3 mRNA水平(OR=1.082,95%CI:1.037-1.129,P<0.05)为ACHBLF患者预后的独立预测因素。6、慢加急性乙型肝炎肝衰竭3个月的死亡率与ALT(P=0.002)、TBIL(P<0.001)、PTA(P<0.001)、INR(P<0.001)、肝硬化(P=0.016)、肝性脑病(P<0.001)、腹水(P=0.006)和MELD积分(P<0.001)显著相关。同时,死亡组的RIPK3 mRNA水平明显高于存活组(P<0.001)。7、当用于预测慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者3个月生存状况时,外周血单个核细胞中的RIPK3 mRNA水平的受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.810,高于MELD积分(0.766)。选取最佳诊断截点8.81,RIPK3 mRNA水平的诊断灵敏性为80.7%,特异性为69.2%,阳性诊断率为69.7%,阴性诊断率为80.4%。同时,RIPK3 mRNA>8.81的患者3个月生存率明显低于RIPK3 mRNA≤8.81的患者。结论本研究证实慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血PBMCs中的RIPK3 mRNA水平与患者病情严重程度及不良预后明显相关。这也预示着,坏死性凋亡可能在慢加急性乙型肝炎肝衰竭的发病机制中发挥着重要作用。第二部分RIPK3 mRNA在肝细胞癌患者中的表达及其在疾病早期诊断中的价值研究背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全世界的健康问题。如果不进行有效的干预,HBV感染可能发展成危及生命的情况,如肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。从全球角度来看,HBV感染是引起肝癌主要原因。虽然在过去的几十年中,肝细胞癌的治疗取得了令人鼓舞的进展,预期存活时间已经延长,但晚期肝细胞癌患者的预后仍然很差。因此,早期准确的筛查和诊断在肝细胞癌的管理中至关重要。血清标志物对肝细胞癌的早期诊断具有极大的价值,其中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)作为早期筛查指标被广泛应用。然而,由于AFP缺乏一定的灵敏性,临床中迫切需要替代的或者联合检测的血清标志物,从而更好的早期诊断肝细胞癌。受体相互作用蛋白激酶 3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3)是坏死性凋亡的关键调控因子,坏死性凋亡是一种程序性细胞坏死,而不是简单的坏死。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是诱导坏死性凋亡的重要细胞因子。当caspase-8被抑制会导致受体相互作用蛋白激酶1(Receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)和RIPK3结合,从而引起坏死性凋亡的起动。混合系列蛋白激酶结构域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)被认为是坏死的主要下游目标,它触发了活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生以及钙离子细胞毒性的流入,最后导致细胞坏死。虽然已经发现异常细胞死亡导致肝细胞癌的发生,但是不同细胞的凋亡在肝细胞癌的发病机制和进展中起着不同的作用。并且非肝细胞凋亡在肝细胞癌中的重要性在很大程度上是未知的。因此,在肝细胞癌中,关键的坏死性凋亡调节因子RIPK3和临床相关性仍需要进一步研究。研究目的为了确定坏死性凋亡相关因子RIPK3在肝细胞癌中的作用,我们通过检测肝细胞癌患者外周血PBMCs中RIPK3 mRNA水平,分析其与各项临床指标的相关性,并明确其在肝细胞癌患者筛查中的应用价值。研究方法本研究共入组80名肝细胞癌患者,27名肝硬化患者,27名慢性乙型肝炎患者,和26名健康对照者。入选的患者均来自2018年10月至2019年10月在山东大学齐鲁医院肝病科病房住院的患者。健康对照者为年龄、性别相匹配的健康志愿者。采集各研究对象清晨空腹外周静脉血,采用密度梯度离心分离法提取外周血 PBMCs。采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法测定患者外周血PBMCs中RIPK3 mRNA表达水平。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定患者的TNF-α、MLKL和caspase-8的血清含量。所有统计学处理采用统计软件SPSS 19.0版本分析。P<0.05定为差异有统计学意义。研究结果1、研究显示,肝细胞癌患者外周血PBMCs中RIPK3mRNA表达水平明显升高。与肝硬化患者(P=0.005),与慢性乙型肝炎患者(P<0.001)以及健康对照者(P<0.001)相比,肝细胞癌患者的RIPK3 mRNA水平显著升高。同时,慢性乙型肝炎患者的RIPK3的表达明显高于健康对照者(P<0.001)。2、在肝细胞癌患者中,我们分析了 RIPK3mRNA表达水平与临床参数的相关性。存在腹水的肝细胞癌患者中RIPK3的表达明显高于无腹水者(P=0.021)。更重要的是,在晚期肝细胞癌患者中观察到RIPK3 mRNA的表达增加。Ⅲ期肝细胞癌患者RIPK3的mRNA水平明显高于Ⅱ期(P=0.049),Ⅳ期肝细胞癌患者的RIPK3的表达明显高于Ⅲ期肝细胞癌患者(P=0.002)。此外,通过Spearman相关分析表明,RIPK3 mRNA表达水平与TBIL(r=0.244,P=0.029)和INR呈明显正相关(r=0.236,P=0.035),与 ALT(r=0.196,P=0.081)、ALB(r=0.196,P=0.081)及 AFP(r=-0.113,P=0.347)没有显著相关。3、肝细胞癌患者与肝硬化患者(P=0.006)、慢性乙型肝炎患者(P=0.001)及健康对照者(P<0.001)相比,血清TNF-α表达水平明显升高。在肝硬化组和慢性乙型肝炎组(P=0.250)之间TNF-α的血清水平没有显著差异。而且血清TNF-α水平与RIPK3的表达之间呈正相关(r=0.371,P<0.001)。肝细胞癌患者与肝硬化患者(P=0.001)、慢性乙型肝炎患者(P<0.001)及健康对照者(P<0.001)相比,血清MLKL水平显著增加。MLKL的血清水平在肝硬化组和慢性乙型肝炎组之间没有显著差异(P=0.869)。MLKL血清水平与RIPK3表达之间呈显著正相关(r=0.571,P<0.001)。肝细胞癌患者和肝硬化患者(P<0.001)、慢性乙型肝炎患者(P=0.001)以及健康对照者(P<0.001)相比,caspase-8的血清水平明显较低。caspase-8的血清水平在肝硬化组和慢性乙型肝炎组之间没有显著差异(P=0.952)。caspase-8血清水平与RIPK3表达之间呈明显的负相关(r=-0.240,P<0.05)。4、我们采用受试者工作特征曲线下面积(AUC)评估血清RIPK3 mRNA水平对肝细胞癌的早期诊断价值。从肝硬化患者中诊断肝细胞癌时,血清RIPK3 mRNA 水平的 AUC 为 0.683[P=0.005,95%置信区间(confidence interval,CI)0.573-0.794)],诊断灵敏性为 0.663,特异性为 0.593,可与 AFP(AUC 0.701,P=0.002,95%CI 0.603-0.799;灵敏性0.650、特异性0.778)相媲美。联合应用RIPK3 mRNA水平和AFP则可大大提高了对肝细胞癌的诊断效能(AUC 0.817,P<0.001,95%CI 0.737-0.896,灵敏性 0.675,特异性 0.852)。5、从慢性乙型肝炎患者中诊断肝细胞癌时,血清RIPK3 mRNA水平的AUC为 0.746(P<0.001,95%CI 0.649-0.844),诊断灵敏性为 0.763,特异性为 0.667,优于 AFP 检测(AUC 0.636,P=0.035,95%CI 0.526-0.747,灵敏性 0.588,特异性0.741)。同样,联合应用RIPK3 mRNA水平和AFP明显提高了对肝细胞癌的诊断效能(AUC 0.775、P<0.001、95%CI 0.674-0.876、灵敏性 0.663、特异性0.815)。6、从正常人群中诊断肝细胞癌时,血清RIPK3 mRNA水平的AUC为0.985(P<0.001,95%CI 0.966-1.000),诊断灵敏性为0.925,特异性为0.962,优于AFP 检测(AUC 0.807、P<0.001、95%CI 0.727-0.887、灵敏性 0.675、特异性0.962)。联合应用RIPK3 mRNA水平和AFP用于诊断肝细胞癌的AUC为0.990(P<0.001,95%CI 0.974-1.000,灵敏性 0.975,特异性 0.999)。结论外周血PBMCs中RIPK3 mRNA水平与肝细胞癌患者的临床分期等指标明显相关。同时,RIPK3 mRNA水平对肝细胞癌的筛查具有明显的价值。联合应用RIPK3 mRNA水平和AFP可明显提高AFP对肝细胞癌的诊断效能。这些发现揭示了坏死性凋亡相关因子RIPK3在肝细胞癌中发挥了重要作用,为肝细胞癌的临床诊治提供了指导。