众所周知，大多数哺乳动物的生精过程对热很敏感，高温可导致生精过程阻断和生精细胞凋亡。本实验室前期研究发现:对小鼠睾丸进行42℃，30min的热激处理，8h后，大部分生精细胞进入凋亡途径，但有少量的生精细胞仍未发生凋亡，只是细胞周期阻滞在G2/M期。这些细胞以什么机制抵御热激的损伤，至今仍无法解释。结合内质网应激途径诱导细胞自噬的特征，我们注意到，生精细胞对热敏感的异质性说明有些细胞可通过细胞自噬抵制热激对细胞产生的损伤。　　 汤雪明等报道，大鼠睾丸中间质细胞产生自发自噬的频率很高，支持细胞次之，但精原细胞、初级精母细胞和精子细胞中未发现自发的自噬。结合细胞自噬的诱因和功能，我们初步研究了小鼠生精细胞中是否产生自噬以及诱导生精细胞产生自噬的条件等。　　 本研究首先从建立小鼠睾丸组织曲细精管体外培养模型入手，检测了曲细精管在应对饥饿、缺氧、氧化应激、高温等环境诱因时自噬相关蛋白Hsp90、Hsp70、LC3表达量的变化。并用透射电镜法检测了饥饿处理后曲细精管生精细胞及支持细胞内自噬体的产生情况。　　 结果显示，饥饿、缺氧、高温均能通过增加LC3Ⅱ的表达量或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，使曲细精管内自噬水平升高。电镜检测结果显示，有血清培养6h后，曲细精管生精细胞及支持细胞内均能检测到自噬体，无血清饥饿体外培养6h后，生精细胞及支持细胞中自噬体出现的频率增加，晚期自噬体有增多的趋势，且饥饿处理时，Hsp90、Hsp70的表达量也相对增加。自噬抑制剂3-MA可通过抑制Ⅱ型LC3的表达或者Ⅰ型LC3向Ⅱ型LC3的转换而对自噬起抑制作用，并且可以增加Hsp90的表达量，而对Hsp70的表达量影响不大。与培养于33℃的曲细精管相比，培养于37℃时，自噬活性随时间的延长而增加，但Hsp90、Hsp70的表达量变化不明显。氧化应激对曲细精管中自噬相关蛋白Hsp90、Hsp70、LC3的表达量影响较小。　　 由于小鼠睾丸组织曲细精管内存在多种细胞类型，且支持细胞是与生精细胞接触的唯一体细胞，并在生精过程中起着至关重要的调控作用，因此，分别研究支持细胞与生精细胞的自噬情况具有重要的理论意义。我们用原代培养的方法分离并纯化了幼鼠睾丸组织支持细胞，免疫双荧光法检测了支持细胞的分离纯化程度。双酶消化法分离了成年雄性小鼠睾丸组织生精细胞。　　 通过无血清（饥饿）体外培养、缺氧（氮气培养法）体外培养、热激处理的方法分别建立生精细胞、支持细胞的自噬模型，Western Blotting法检测自噬相关蛋白LC3、CMA途径相关蛋白LAMP-2表达量的变化，吖啶橙染色法检测酸性膜泡，透射电镜法检测自噬体的生成情况。　　 结果显示，正常培养的支持细胞内即有较高水平的自噬，无血清（饥饿）体外培养、缺氧（氮气培养法）体外培养、热激处理可在一定程度上增加支持细胞内的自噬水平。缺氧（氮气培养法）体外培养、热激处理可在一定程度上增加CMA途径相关蛋白LAMP-2的表达，无血清（饥饿）体外培养下LAMP-2的变化不大，但免疫荧光结果显示，无血清（饥饿）体外培养下，与对照组相比LAMP-2更趋向于存在于细胞核周围的溶酶体内。与对照组相比，N2培养6h、无血清培养6h、热激30 min后培养6h后，支持细胞内酸性膜泡的含量有一定程度的升高.其中以无血清培养6h时较为显著。透射电镜结果显示，此3种处理情况下支持细胞内均能产生部分自噬体，且多以早期自噬体的形式存在。　　 正常培养的生精细胞内自噬水平较低。缺氧（氮气培养法）体外培养能更加有效地增加生精细胞内LC3Ⅱ的表达，可将其方法发展成诱导生精细胞自噬的体外模型。6h之内的无血清培养不能有效地诱导生精细胞自噬。热激后不久(2h)，生精细胞内LC3Ⅱ的表达量略有上调。与对照组相比，N2培养6h、无血清培养6h后，生精细胞内酸性膜泡的含量有所升高。透射电镜结果显示，此3种处理情况下生精细胞内均能产生部分自噬体。正常培养的生精细胞内CMA途径相关蛋白LAMP-2表达量很低或几乎不表达，无血清（饥饿）体外培养、缺氧（氮气培养法）体外培养、热激处理后也未能诱导其表达，推测生精细胞内分子伴侣介导的自噬(CMA)水平较低。　　 由于生精细胞的自噬水平很低，且不易被诱导，因而生精细胞易受不利因素的影响，当生精细胞遭受热激等不利因素作用后，绝大多数自噬水平很低的生精细胞会进入凋亡途径。