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课题背景:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL),也称APO-2L(apoptosis-2ligand)。1995年,Wiley等从人外周血液淋巴细胞(PBL)和人心脏cDNA文库中,利用与TNF同源的表达序列标签(EST),分析出了TRAIL的cDNA(1769bp)序列,并初步检测了它的生物学活性。用Northern杂交法在人体多种组织中都可检测到TRAIL的表达,尤其是脾、肺和前列腺等,但在脑和睾丸中未见表达。TRAIL作为TNF家族新发现的成员,是与TNF家族成员序列有同源性的蛋白分子,由于其可选择性杀伤肿瘤细胞,而不杀伤正常细胞,成为目前肿瘤生物治疗的研究热点之一。近来虽曾一度有报道TRAIL可诱导人正常肝细胞凋亡,但最新的研究证实其毒性主要是因为产品中的杂质所致,而与TRAIL本身无关。本文采用大肠杆菌系统制备TRAIL,观察TRAIL作用于不同肿瘤细胞引起的形态学变化,检测其生长抑制率、细胞凋亡率及对肿瘤细胞周期的影响,分析TRAIL与细胞凋亡之间的量效关系和时效关系;检测TRAIL受体在乳腺癌组织中的分布,揭示TRAIL受体的表达水平与乳腺癌组织分化、临床分期、淋巴结转移之间的关系;作用于接种骨髓瘤小鼠,分析不同给药途径、方式、剂量对疗效的影响,旨在研究TRAIL抗肿瘤的体内生物学活性,从而为其进一步应用于临床提供实验理论基础。实验方法:1、细胞学实验:按常规方法复苏、培养细胞,加入40、20、10、5、2.5、1.25、0.6ug/ml TRAIL,光镜下观察作用12、24、48、72h后细胞形态学变化;MTT法测作用48h后细胞生长抑制率;流式细胞仪测2ug/mlTRAIL作用JurkatT细胞0、6、12、24、48、72h时细胞凋亡率及对细胞周期的影响。2、组织学实验:TRAIL单抗作用于乳腺癌组织,设阴性对照,免疫组化法检测TRAIL受体在乳腺癌组织中的分布。3、体内实验:雄性BALB/C小鼠每只18±2g,共36只,随机分6组,每组6只:对照组(A组),腹腔高剂量组(B1组),腹腔低剂量组(B2组),瘤周高剂量组(C1组),瘤周低剂量组(C2组),腹腔高剂量预防组(D组)。对照组(A组)不给药;治疗组(B1、B2、C1、C2组)接种后1周给药,持续1周,每日固定时间给药1次;预防组(D组)接种同时给药,持续1周,每日固定时间给药1次。高剂量组每只给药剂量为1.5ug/g,低剂量组每只给药剂量为0.5ug/g。每只小鼠左侧臀部皮下接种9.25*10~6个/ml骨髓瘤细胞0.2ml。2周后杀鼠测量瘤重、瘤体,常规HE染色观察肿瘤组织形态。主要结果:1、TRAIL对肿瘤细胞作用1.1 TRAIL对肿瘤细胞形态学影响不同浓度TRAIL分别作用各细胞株不同时间后,可观察到:7402细胞在24h后≥20ug/ml剂量组即出现细胞固缩现象,LS174-T细胞、MCF-7细胞、GLC细胞在48h后40ug/ml组可见细胞脱壁、固缩,密度增加,Jurkat T细胞24h后各剂量组均有不同程度固缩,核染色质浓缩,细胞成簇性降低,散在细胞增多。各对照组细胞生长良好。各细胞株随作用时间延长发生凋亡形态学改变的细胞数也随之增多,剂量越高越早出现变化。1.2 TRAIL对肿瘤细胞生长抑制率的影响总体上说,TRAIL对各肿瘤细胞的生长抑制率随浓度升高而增加。但不同肿瘤细胞对TRAIL的敏感性不同,其中Jurkat T细胞最为敏感,在TRAIL浓度为5ug/ml时生长抑制率即达80.17%。GLC、MCF-7细胞在TRAIL浓度＜5ug/ml,LS174-T、7402细胞在TRAIL浓度＜10ug/ml时,生长抑制率大为下降,但仍表现出微弱的抑制增长效应。LS174-T细胞在TRAIL＞50ug/ml时抑制效应略有下降。1.3 TRAIL对Jurkat T细胞凋亡率和细胞周期的影响TRAIL诱导Jurkat T细胞6h后,即出现明显的细胞凋亡,凋亡率为37.3%,随时间延长,凋亡率升高,呈一定的时效关系。除0h处理组外,其余组均与空白对照组之间有显著性差异(P＜0.01)。只是72h、48h处理组与24h组相比略有下降,但经统计学分析,三组之间无显著性差异。分析各时间点细胞的G0、G1、M、S期分布,未发现明显规律性变化。2、TRAIL受体在乳腺癌组织中的分布情况:TRAIL在高、中分化腺癌表达明显高于低和未分化腺癌(P＜0.01),而在早中期腺癌组和晚期腺癌组中的表达无差异(P＞0.05),伴有淋巴结转移组和无转移组之间表达无差异(P＞0.05)。3、TRAIL对接种骨髓瘤细胞小鼠的抗瘤作用3.1瘤重、瘤体比较:除腹腔低剂量组外的治疗组、预防组均有一定的抗瘤作用(P＜0.01);相同给药方式,高剂量组抗瘤作用优于低剂量组(P＜0.01),呈一定的量效正相关关系;相同剂量,瘤周给药方式疗效优于腹腔给药方式(P＜0.05)。腹腔高剂量治疗组与腹腔高剂量预防组无明显统计学差异(P＞0.05)。3.2光学显微镜下观察:对照组肿瘤细胞生长活跃,癌细胞弥漫分布;腹腔高剂量组可见较多细胞出现凋亡改变,胞膜皱缩,核固缩、碎裂,散在单个分布;腹腔低剂量组少量细胞出现凋亡改变;瘤周高剂量组细胞出现明显凋亡现象,形成大小不等的凋亡小体;瘤周低剂量组部分细胞出现凋亡改变;腹腔高剂量预防组可见少量细胞胞浆溶解,核空泡。结论:1、TRAIL能不同程度抑制肿瘤细胞增殖,各细胞株对TRAIL敏感性不同,达到相同生长抑制率的时间和所需TRAIL浓度不同,其中,Jurkat T细胞最为敏感。TRAIL蛋白分子能通过诱导细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞,提示其对肿瘤细胞的生长抑制作用可能是通过诱导其细胞凋亡实现的。TRAIL对细胞的诱导凋亡作用未对细胞周期产生规律性影响。2、TRAIL受体的表达可能与乳腺癌的发生、发展密切相关,与乳腺癌的分化程度呈正相关,与癌组织血行转移范围和淋巴结转移无关,提示TRAIL受体表达与乳腺癌生物学行为可能无关。3、TRAIL对皮下移植骨髓瘤小鼠具明显抑瘤作用:局部给药优于全身给药方式,高剂量组疗效优于低剂量组;预防组对疗效的影响并未体现出优势,提示TRAIL在对骨髓瘤的预防治疗方面存在一定的限制。