乙醇酸氧化酶和富含苯丙氨酸的碱性蛋白紧密结合的证据

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乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15GO)是植物光呼吸过程中的关键酶。目前普遍认为GO是由40kD碱性亚基组成的寡聚酶。但该观点难于解释GO具有7.0-10.0近10种不同的等电点。本论文认为是由于纯化的GO被忽略了含有在SDS-PAGE时向负极泳动的蛋白组分,该蛋白组分能够和GO紧密结合,并且富含苯丙氨酸(Phe)。 本论文通过10%醋酸沉淀、硫酸铵分步沉淀、SephadexG-50柱和DEAE-cellulose柱层析,获得高活性的菜心GO,经SDS-PAGE,只有一条40kD大小的蛋白带。 测定了GO40kD亚基和“纯化”的GO的氨基酸组成,40kD亚基碱性和酸性氨基酸比例为0.54,而“纯化”的GO的碱性和酸性氨基酸比列为0.74。GO的40kD亚基和“纯化”的GO的苯丙氨酸、半胱氨酸(Cys)的含量也不同,因此还存在一个蛋白,该蛋白应该是偏碱性、Cys含量低,以及Phe含量高的蛋白。GO各纯化步骤的蛋白样品作SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,结果发现纯化过程中各步骤的样品在正极和负极均有蛋白带。采用过SephadexG-50层析获得的部分纯化的GO样品,加SDS裂解液变性后做制备性SDS-PAGE,发现有蛋白在SDS变性下能向负极泳动,并且负极缓冲液蛋白苯丙氨酸含量达到60%。制备了GO40kD亚基和负极缓冲液富含苯丙氨酸碱性蛋白的抗体。“纯化”的菜心绿叶GO对负极缓冲液富含苯丙氨酸碱性蛋白的抗体作SDS-PAGEWesternblot,能识别66-50kD之间的三条印迹带,表明“纯化”的菜心GO中存在富含苯丙氨酸的碱性蛋白。 “纯化”的菜心绿叶GO经SDS-PAGE,有时会有一条40kD主带和75kD次带,40kD主带和75kD次带均可以被GO40kD亚基的抗体所识别,表明75kD可能是GO40kD未彻底解离的二聚体。 “纯化”的菜心GO经SDS变性后过SephadexG-100柱,得到分子量分别为67kD和介于67kD与10kD之间的峰Ⅰ蛋白G-100和峰Ⅱ蛋白G-100。氨基酸组成测定表明两个峰蛋白的组分稍有不同。峰Ⅰ蛋白G-100和峰Ⅱ蛋白G-100经SDS-PAGE后呈40kD一条蛋白带。峰Ⅰ蛋白G-100和峰Ⅱ蛋白G-100对GO40kD亚基抗体作SDS-PAGEWesternblot,也呈40kD一条蛋白带。表明两个峰蛋白都含GO40kD亚基。 “纯化”的菜心GO、峰Ⅰ蛋白G-100和峰Ⅱ蛋白G-100对富含苯丙氨酸的碱性蛋白的抗体作SDS-PAGEWesternblot,均有67-50kD三条印迹带。可见,峰Ⅰ蛋白G-100和峰Ⅱ蛋白G-100同样是含有GO和富含苯丙氨酸的碱性蛋白。 “纯化”的GO经SDS-PAGE,只有一条40kD蛋白带,但同一GO经SDS-毛细管电泳,则只有108kD蛋白带,表明GO的40kD和67-50kD大小的富含苯丙氨酸的碱性蛋白紧密结合,以至SDS变性都不能使两者分开。
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