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前言幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是人消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌及胃粘膜相关淋巴瘤的重要致病因子。H.pylori已经被世界卫生组织定义为人类一级致癌物,但是在H.pylori感染率较高的国家,如印度、泰国等,胃癌的发病率却很低,同时研究发现在感染H.pylori的人群中,只有不到3%的携带者能发展为胃癌,这些说明因H.pylori感染而导致胃疾病发生发展的过程中,有遗传易感性、机体免疫状态以及环境饮食等因素的共同参与。研究发现作为宿主遗传因素,细胞因子基因多态与H.pylori感染个体胃癌易感性密切相关,并且有明显的地域族群分布特点。在胃癌高发的东亚地区,M hyauchi, Ayumu Taguchi等人发现趋化因子(chemokines)白细胞介素一8(interleukin - 8, IL-8)启动子区251A／T基因多态的AA基因型是日本人胃癌及癌前疾病的易感基因型。Wanli Lu, Sharon A. Savage等人发现IL-8—251AA基因型是中国人群胃癌及食管癌易感基因型。我室前期研究也发现IL-8—251AA基因型是胃癌及癌前疾病的易感基因型。而在东亚以外的其他胃癌高发区,Sharon A. Savage, Castanheira.Vale AJ, Elvira Garza. Gonzalez等人研究发现IL-8—251AT基因型无胃疾病易感性。为什么仅在胃癌高发的东亚地区,H.pylori感染个体IL-8—251A等位基因是胃癌易感基因型,其中机制尚不清楚；H.pylori感染对不同IL-8—251A／T多态型个体基因转录表达影响如何,目前尚未见报道；H.pylori是否通过促进IL-8—251AA基因型的高表达而导致胃癌及其癌前疾病的易感,有待验证。本研究通过H.pylori与原代培养的正常胃粘膜上皮细胞共作用探讨H.pylori感染对IL-8—251A／T多态型个体IL-8基因转录表达的影响。期望明确H.pylori感染与IL-8—251A／T基因多态型个体胃癌易感性之间的关系及机制。目的明确H.pylori感染对原代培养的人胃粘膜细胞IL-8蛋白表达的影响；明确H.pylori对不同IL-8—251A／T基因多态型人胃粘膜细胞IL-8基因表达的影响。方法本研究采用脑心浸液琼脂培养基进行H.pylori复苏培养；采用原代细胞培养技术进行人胃粘膜细胞的培养,通过HE染色、免疫组化、倒置显微镜下观察证明培养细胞为胃粘膜上皮细胞；采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR)方法检测IL-8—251A／T基因多态型,细菌与细胞共培养,采用Real time RT-PCR方法检测不同IL-8—251A／T基因多态型IL-8mRNA扩增效率,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测细胞培养上清中IL-8蛋白含量,计算加菌前后IL-8蛋白表达变化率=(加菌后IL-8蛋白表达量-加菌前IL-8蛋白表达量)／加菌前IL-8蛋白表达量。结果一、人胃粘膜细胞原代培养及鉴定用于原代上皮细胞培养的胃粘膜组织取自胃大部切除手术标本胃底体部,HE染色镜下观察为正常胃体粘膜。原代培养细胞倒置显微镜观察：接种第2天可见细胞呈团簇状生长,细胞簇上面多残存粘膜组织碎块。接种第3天细胞增殖迅速,以细胞簇为中心向外周生长,与附近的细胞群相连成片。接种第4天细胞铺满皿底约70%,细胞生长状态良好,单层贴壁生长,呈菱形或多边形,核大呈卵圆形。原代培养细胞胃蛋白酶原C(PGC)免疫细胞化学染色显示胞浆和／或胞膜阳性着色,提示培养细胞为胃上皮细胞来源二、H.pylor作用24小时前后原代胃粘膜上皮细胞上清液IL-8蛋白含量平均值比较加菌前平均蛋白含量为11301.94pg/ul,加菌后为15836.29 pg／ul,二者之间t检验未见显著统计学差异P=0.331,但是趋势显示加菌后IL-8诱导分泌增多。三H.pylori对原代培养的不同IL-8—251A／T多态型人胃粘膜细胞IL-8基因转录表达的影响(一)不同IL-8—251A/T基因多态型IL-8mRNA扩增效率的比较,IL-8—251TT型扩增效率平均值为1.45,AT型为1.603,AA型为11.814,单向方差分析表明AT型、AA型等位基因扩增效率与TT型相比P分别为0.979和0.158,从扩增效率来看,AA型是相对高表达的基因型。(二)携带IL-8—251AA基因型的原代培养胃粘膜细胞加菌前后IL-8蛋白表达变化率(0.468±0.401)高于其他型AT(0.443±0.205)、TT(0.154±0.207),AT基因型高于TT型,AA型和AT型与TT型相比,P值分别为0.181,0.197,各组间差异无显著统计学意义,但可以看出具有一定的趋势,IL-8—251AA基因型要高于其他组。结论1、H.pylori可以诱导原代培养的人胃粘膜上皮细胞IL-8表达。2、H.pylori对不同IL-8—251A/T基因多态型人胃粘膜细胞IL-8蛋白表达的影响不同,携带IL-8—251AA基因型的胃粘膜细胞IL-8蛋白表达相对高于其他型。