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目的:肝缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury,IRI）是肝移植中最常见的并发症之一,是几乎难以避免的一种肝脏损伤过程,它可以通过启动炎症瀑布级联反应等一系列分子事件,严重影响着患者预后。然而,迄今为止临床上行之有效的针对肝IRI的诊疗方案仍然处于匮乏状态。因此,寻找肝IRI中潜在的诊疗靶点是肝病工作者尤其是肝移植工作者的重要任务。micro RNA（mi R）-450b-5p是近期在实体器官免疫中崭露头角的非编码微小RNA,尽管我们的前期实验鉴定出mi R-450b-5p在肝IRI模型中的显著上调,但目前尚无mi R-450b-5p在肝IRI中的相关研究。进一步的,通过生物信息学手段,我们发现αB-晶状体蛋白（αB-crystallin,CRYAB）,一种广泛存在于人体的抗炎蛋白,可能是mi R-450b-5p的预测靶点。尤其是,我们的前期实验表明CRYAB在肝IRI模型中显著下调,与mi R-450b-5p负相关。基于此,我们推测mi R-450b-5p可能通过靶向CRYAB促进肝IRI的发生发展。本研究旨在检测mi R-450b-5p和CRYAB在肝缺血再灌注损伤的动物模型及细胞模型中的表达情况,并通过进一步明确mi R-450b-5p对CRYAB的靶向作用,验证mi R-450b-5p和CRYAB在肝IRI动物模型和细胞H/R模型中的免疫调节功能。最后,我们在肝IRI的细胞模型中初步探讨了mi R-450b-5p和CRYAB的调控机制,为肝IRI的临床诊疗提供一定的研究基础与临床转化思路。方法:1.使用RAW 264.7细胞系作为定居肝脏的巨噬细胞即Kupffer细胞的经典替代细胞株,建立细胞缺氧/复氧模型,该模型为肝IRI的体外模型,能够模拟细胞在肝IRI中经历的病理过程。设置缺氧/复氧时间梯度,使用q RT-PCR检测CRYAB、mi R-450b-5p和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）的表达;使用Western Blot检测CRYAB、核因子κB抑制蛋白（Inhibitor of NF-κB,IκBα）、p-IκBα、核因子κB（Nuclear facter of kappa B,NF-κB）p65、p-p65、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶14（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 14,NIK）和NF-κB p52的蛋白表达情况。综合考虑q RT-PCR和WB的结果,从而筛选出较为理想的细胞缺氧/复氧的时间点组合以供后续体外实验。2.在细胞中干扰mi R-450b-5p和CRYAB的表达,WB检测CRYAB、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-p65、NIK和NF-κB p52的蛋白表达情况;使用免疫荧光检测p65的入核情况;使用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测3种炎症因子在细胞上清液中的水平,包含在肝IRI中具备代表性的TNF-α、白介素（interleukin,IL）-1β和IL-6;使用双荧光素酶报告基因实验明确mi R-450b-5p对CRYAB的靶向作用。3.使用C57BL/6J小鼠建立肝IRI动物模型,使用ELISA检测炎症因子在小鼠血清中的释放水平,使用q RT-PCR检测小鼠肝脏mi R-450b-5p的水平;在小鼠体内干扰CRYAB和mi R-450b-5p的表达,使用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察小鼠肝脏病理改变（依据经典的Suzuki评分标准）;使用末端脱氧核苷酸转移酶d UTP标记（terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick-end labeling,TUNEL）法在干扰CRYAB和mi R-450b-5p表达后评估肝IRI中小鼠肝脏细胞凋亡;使用ELISA检测干扰后mi R-450b-5p和CRYAB后小鼠血清中的炎症因子释放;使用肝酶检测试剂盒评估天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）在肝IRI小鼠血清中的释放情况。4.体外使用IKKβ特异性通路抑制剂IMD 0354,同时干扰CRYAB表达后,免疫荧光观察IKKα和IKKβ亚基的活化情况;Western Blot检测CRYAB、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-p65、NIK、NF-κB p52、IKKβ、p-IKKβ、IKKα、p-IKKα、IKK、p-IKK和IL-1β的蛋白表达;ELISA检测炎症因子在细胞上清液中的水平。5.体内使用IMD 0354并干扰CRYAB的表达,HE染色观察小鼠肝脏病理改变;TUNEL评估小鼠肝脏细胞凋亡情况;ELISA检测小鼠血清炎症因子水平;肝酶检测试剂盒检测小鼠血清ALT、AST水平。6.体外干扰mi R-450b-5p和CRYAB的表达,WB检测巨噬细胞M2型极化marker Arg-1、TGFβ1、丝氨酸/苏氨酸激酶1（serine/threonine kinase 1,AKT1）、p-AKT1、雷帕霉素激酶靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase,m TOR）、p-m TOR、核糖体蛋白S6激酶、p-S6K、真核翻译起始因子4E结合蛋白和p-4E-BP的蛋白表达;q RT-PCR检测巨噬细胞M2型极化marker的m RNA水平;免疫荧光检测巨噬细胞M2型极化marker的活化情况。7.体外使用m TOR激活剂MHY 1485,同时干扰CRYAB,Western Blot检测Arg-1、TGFβ1、AKT1、p-AKT1、m TOR、p-m TOR、S6K、p-S6K、4E-BP和p-4E-BP的蛋白表达;q RT-PCR检测细胞M2 marker的m RNA水平;免疫荧光检测M2 marker的活化情况。8.体内干扰CRYAB,同时使用IMD 0354与MHY 1485,HE染色根据Suzuki评分评估小鼠肝IRI后肝脏病理损伤;肝酶试剂盒检测小鼠血清肝酶水平;TUNEL评估小鼠肝IRI后肝脏细胞凋亡。结果:1.mi R-450b-5p、IκBα/NF-κB p65和NIK/NF-κB p52炎症信号通路蛋白的表达在细胞H/R模型中显著上调,而CRYAB的表达显著下降。结合q RT-PCR和Western Blot的结果,我们选择缺氧6小时/复氧12小时以便进行后续的体外实验。2.在细胞H/R模型中抑制mi R-450b-5p可以上调CRYAB的表达,并能够同时抑制IκBα/NF-κB p65和IKKβ的炎症信号活化,而进一步抑制CRYAB可以显著逆转mi R-450b-5p抑制剂所带来的抑炎效果。mi R-450b-5p/CRYAB对NIK/NF-κB p52和IKKα的活化并无显著影响。3.mi R-450b-5p在小鼠IRI模型中显著上调,体内抑制mi R-450b-5p能够显著缓解小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡、炎症因子及肝酶的释放,而进一步抑制CRYAB则显著逆转了mi R-450b-5p抑制剂在体内所取得的抑炎效果。4.在细胞H/R模型中使用IKKβ特异性抑制剂IMD 0354显著逆转了下调CRYAB后对IκBα/NF-κB p65和IKKβ炎症信号的影响,在小鼠肝IRI模型中使用IMD 0354显著逆转了下调CRYAB对小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡、血清炎症因子及肝酶释放的影响。5.在细胞H/R模型中抑制mi R-450b-5p能够显著增强AKT1/m TOR信号蛋白以及M2极化marker,进一步抑制CRYAB可以逆转mi R-450b-5p抑制剂带来的影响。6.在细胞H/R模型中使用m TOR激动剂MHY 1485显著逆转了下调CRYAB对M2极化marker和AKT1/m TOR信号蛋白的影响。7.在小鼠IRI模型中同时使用IKK抑制剂IMD 0354和m TOR激动剂MHY 1485可以显著逆转下调CRYAB对小鼠肝脏病理损伤、细胞凋亡及血清肝酶的影响。结论:1.mi R-450b-5p在肝IRI小鼠模型和细胞H/R模型中显著上调,CRYAB显著下调。2.mi R-450b-5p可以通过直接靶向CRYAB加剧肝IRI的发生。3.mi R-450b-5p/CRYAB轴对肝IRI的调控是通过IKK/NF-κB p65及AKT/m TOR信号实现的。