中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后难以自我修复,主要原因在于细胞的丢失、神经元突起的断裂、以及抑制突起再生环境的形成。目前,最有希望的治疗手段就是利用组织工程的方法对损伤区域进行合适的组织细胞和支架材料的移植,通过支架材料本身的物理和化学性质调节细胞的行为以及组织的形成,改善损伤区域的抑制性环境。为了设计出最符合移植需要的支架材料,近年来国内外学者对神经系统来源的细胞与生物材料间相互作用进行了一些研究。本文利用不同走向的家蚕丝素蛋白纳米纤维支架作为中枢神经系统终端分化细胞和神经干细胞的生长基质,探讨家蚕丝素蛋白纳米纤维的排列走向对修复细胞的引导作用以及丝素蛋白纳米纤维在中枢神经系统损伤修复上应用的可能性。本研究首先在体外培养得到了星形胶质细胞、神经元及神经干细胞,并通过细胞形态、生长特性及特异性抗原表达(GFAP,β-III-tubulin及nestin等)对细胞进行了鉴定。结果显示:(1)通过反复传代的方法纯化了星形胶质细胞(纯度在92%以上);(2)体外培养的神经元具有典型的特征,突起明显,生长状态较好;(3)脑室下区(subventricular zone, SVZ)来源的的神经干细胞悬浮培养3 d即可形成神经球。神经巢蛋白(nestin)特异性抗原证明此培养体系下的神经干细胞阳性比例较高,同时分化实验也证明了所得到的细胞可分化为神经元和神经胶质细胞。接下来将体外培养的星形胶质细胞、神经元及神经干细胞接种到平行排列或者随机排列的家蚕丝素蛋白纳米纤维上。实验结果表明:(1)星形胶质细胞在家蚕丝素蛋白纳米纤维上具有正常的粘附、生长和迁移等行为。星形胶质细胞的生长依赖于丝素蛋白纳米纤维,纤维的走向对细胞的迁移以及伸展具有引导作用。与随机排列的家蚕丝素蛋白纳米纤维相比,平行排列的家蚕丝素蛋白纳米纤维上胶质细胞铺展面积较小,但伸展长度较长。同时,平行排列的家蚕丝素蛋白纳米纤维能能引导星形胶质细胞进行更有效的迁移(迁移效率为位移与迁移总距离的比值)。(2)家蚕丝素蛋白纳米纤维支持原代培养的神经元生长,细胞的突起明显,且紧密的依附在家蚕丝素蛋白纳米纤维上,突起的伸展方向与材料走向一致。平行排列的家蚕丝素蛋白纳米纤维上神经元突起数少,但突起总长度与其他组间不存在显著性差异,表明平行的家蚕丝素蛋白纳米纤维能促进突起的定向生长。(3)家蚕丝素蛋白纳米纤维能够维持神经干细胞的未分化特性,引导神经干细胞沿着纤维走向进行迁移以及支持神经干细胞向胶质细胞和神经元的分化。值得注意的是,分化的神经干细胞的迁移同样受到纤维走向的影响。平行排列的家蚕丝素蛋白纳米纤维引导细胞沿着其自身排列走向进行迁移,迁移出的细胞围绕着神经球呈椭圆形分布。在体内,细胞外基质和有序的组织结构影响着细胞突起的生长和延伸,又有研究表明,在中枢神经系统发育时期,星形胶质细胞能够引导神经元的迁移。此外,星形胶质细胞(Astrocyte)始终伴随着神经元的整个发育过程,对维持神经元的生存和神经前体细胞的发育起着重要的作用。因此我们认为或许可以利用支架材料引导胶质细胞的铺展和迁移,从而调控神经元突起的定向生长。为此,我们将星形胶质细胞与神经元共培养在平行排列或者随机排列的家蚕丝素蛋白纳米纤维纤维上,并对神经元的存活以及复杂度(初级突起数目、突起总数目和突起总长度等)进行了检测。实验结果如下:丝素蛋白纳米纤维结合星形胶质细胞能很好地支持神经元的生长,第4 d可见成熟的神经元样细胞。与神经元单独培养在家蚕丝素蛋白纳米材料上相比,共培养组的神经元的存活力、突起数量以及长度均有明显提高。同时,虽然共培养体系中神经元依附在星形胶质细胞上生长,但其突起依然按照家蚕丝素蛋白纳米纤维排列走向进行伸展。以上的研究证明了家蚕丝素蛋白纳米纤维支持星形胶质细胞、神经元以及神经干细胞的粘附、生长与分化,而且对细胞的迁移行为具有引导作用,这些特点使得家蚕丝素蛋白纳米纤维网成为极具开发潜力的神经组织工程替代物,从而为神经再生、神经元突起的生长提供良好的胞外环境,为将来利用家蚕丝素蛋白纳米纤维结合神经类种子细胞治疗神经性缺陷和损伤提供理论基础。