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背景和目的随着人们饮食结构和生活习惯的改变,肥胖的发病率逐年增加,已经成为一类全球性流行性疾病,与糖尿病、高血压、高脂血症、胰腺癌等疾病的发病密切相关,严重威胁着人类的健康。体内的脂肪组织大致分为2类:(1)白色脂肪组织,以甘油三酯的形式储存机体过剩的能量,其在体内的过度积聚使体重超过正常水平即为超重和肥胖,可引起一些系列代谢相关性疾病。(2)棕色脂肪组织,主要通过非耦联氧化磷酸化分解产热,对抗低温环境,并被认为可以改善代谢,但其分布随着年龄的增长而减少。近来在白色脂肪组织中发现了一种功能上和棕色脂肪细胞相似的米色脂肪细胞,其诱导和激活被称为白色脂肪棕色化,而研究显示该棕色化过程可以对抗肥胖,可能会成为预防和治疗肥胖的潜在干预靶点。热休克蛋白A12A(heat shock protein A12A,HSPA12A)是HSP70家族中的新成员,于2003年首次被克隆。课题组前期研究显示,HSPA12A可以促进非酒精性脂肪肝的发生发展,提示HSPA12A可能在脂质代谢方面发挥着某些作用。然而,HSPA12A在脂肪组织中的表达和分布模式,以及在脂肪组织生理和病理生理活动中的作用尚不清楚。本研究旨在初步探讨白色脂肪组织HSPA12A在肥胖和白色脂肪棕色化中的作用,为后续的研究及临床转化提供前期数据。实验方法1.HSPA12A在小鼠不同组织中的表达模式。采用雄性、8周龄、SPF级野生型小鼠,分离包括脂肪在内的多种组织,Western blot法检测各组织中HSPA12A蛋白质相对含量。2.人脂肪组织HSPA12A表达水平与BMI的相关性研究。收集肥胖患者和正常体重人群腹部皮下白色脂肪组织,通过RT-PCR检测其中HSPA12A m RNA表达水平、并与同一人对应的BMI进行一元线性回归分析,分析脂肪组织HSPA12A表达水平与BMI二者之间的相关性。3.Hspa12a基因敲除鼠构建和鉴定。采用Cre-Lox P基因重组系统,建立Hspa12a基因敲除小鼠模型,采用PCR和Western blot检测,以鉴定Hspa12a基因敲除小鼠模型是否构建成功。4.Hspa12a基因敲除对高脂膳食所致肥胖的影响。采用雄性、4周龄、野生型(wild type,WT)和Hspa12a基因敲除(Hspa12a-/-)小鼠,连续高脂(high-fat diet,HFD)喂养14周,测定体重、以分析HSPA12A表达沉默对HFD所致肥胖的影响。5.低温对脂肪组织HSPA12A表达水平的影响。小鼠分别置于25℃室温(room temperature,RT)和4℃低温(low temperature,LT)5天,收取其腹股沟皮下脂肪。通过UCP1免疫组化染色观察其是否发生了白色脂肪棕色化;提取胞浆蛋白、胞核蛋白及总蛋白进行Western blot,检测HSPA12A表达情况;冰冻切片进行HSPA12A免疫荧光染色。6.Hspa12a基因敲除对低温诱导白色脂肪棕色化的影响。采用雄性、8周龄、WT和Hspa12a-/-小鼠,分别置于25℃室温或4℃低温环境下5天,收集小鼠腹股沟皮下脂肪组织,然后采用免疫组化染色和Western blot测定脂肪组织中的UCP-1、PGC-1α的蛋白水平。7.Hspa12a基因敲除对低温所致体温下降的影响。采用雄性、8周龄、WT和Hspa12a-/-小鼠,置于4℃低温环境下,测定各时间点的小鼠肛温。结果1.HSPA12A在脂肪组织中呈相对的高表达状态,仅低于在脑和肾脏组织中的表达。2.肥胖患者腹部皮下脂肪组织中HSPA12Am RNA表达水平较正常体重人群显著增高,且与BMI呈正相关。3.PCR检测和Western blot检测鉴定Hspa12a基因敲除小鼠模型构建成功。4.与普通饲料喂养的WT小鼠组比较,HFD使WT小鼠体重显著增高,然而,Hspa12a-/-鼠的体重在普食喂养组和HFD组没有显著差异。更为重要的是,与HFD的WT小鼠相比,HFD的Hspa12a-/-小鼠体重显著减轻。5.低温刺激后,免疫组化结果显示小鼠腹股沟皮下白色脂肪内的UCP1表达增加,说明棕色化成功被诱导。同时,相比较于室温的小鼠,低温环境中小鼠腹股沟皮下白色脂肪组织中的核内HSPA12A及总HSPA12A蛋白都出现显著增加,而胞浆中的HSPA12A蛋白含量无显著变化。6.低温使二种基因型小鼠腹股沟皮下脂肪组织UCP-1及PGC-1α的表达均增加,且与WT鼠比较,Hspa12a-/-小鼠的UCP-1及PGC-1α的表达水平进一步增加。7.低温环境中,二种基因型小鼠体温都有所下降,但相较于WT小鼠,Hspa12a-/-小鼠体温下降的程度减轻。结论Hspa12a基因敲除可以缓解高脂饮食导致的肥胖,促进低温诱导的白色脂肪棕色化,抑制脂肪组织中的HSPA12A有望成为未来治疗肥胖及其相关代谢疾病的新策略。