聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）是以分子量为44 Da的乙二醇重复单元组成的人工合成聚合物。它被广泛应用作为药用辅料和PEG化药物或PEG化纳米载体的合成,已被批准应用于人体的口服、静脉注射以及皮肤等给药方式。PEG化药物或纳米载体应用于人体后,随着其解聚、泄露或崩解会不断地释放出PEG,体内暴露量也随之不断地增加。长期以来,由于PEG具有较好的水溶性和较低的生物利用度,因此一直被认为是无毒、无免疫原性、无抗原活性的惰性物质。但近年研究却发现,它不仅本身具有一些安全隐患,而且还可与负载的药物之间发生很强的相互作用:1)PEG具有抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的作用,通过该作用会改变P-gp底物药在体内的药代动力学行为,从而产生基于辅料-药物相互作用（excipient-drug interaction,EDI）的用药风险;2)分子量较大的PEG会蓄积在组织中;3)PEG氧化代谢产生的PEG酸毒性高于PEG,会引起酸中毒和高钙血症。更重要的是,不同分子量的PEG具有不同的药代动力学性质,而PEG的多分散性又注定它是由具有一定分子量分布的PEG混合组成的。因此,必须重新认识PEG与P-gp相互作用的机制以及多分散性PEG在细胞及系统水平的药代动力学过程,阐明其毒性的物质基础,揭示EDI的机制,为科学合理设计新型给药系统奠定基础。因此,本论文拟从以下5个方面进行系统地研究与探讨。（1）PEG的加合离子与质谱裂解规律解析建立了将PEG（400-2500 Da）中不同分子量PEG分离的液相方法,在此基础上应用高分辨飞行时间质谱（Triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry,Triple-Q-TOF）探究了PEG 2000中不同分子量PEG的加合离子及质谱裂解规律。结果发现,PEG离子化的过程中,产生的响应最高的离子为+NH₄⁺,其携带的电荷数（n）取决于它的分子量:分子量<648.3843 Da时,n=1;648.3843 Da≤分子量<1176.6902 Da时,n≤2;1176.6902 Da≤分子量<1660.9672 Da时,n≤3;1660.9672 Da≤分子量<2145.2418 Da时,n≤4;2145.2418 Da≤分子量<2500 Da时,n≤5,可见分子量越大的PEG越倾向于携带更多的电荷。随着解簇电压（declustering potential,DP）的增大,PEG倾向于携带较少电荷。DP从50 V增加到100 V时,PEG携带的电荷数几乎无变化;DP从100 V增大到150 V时,携带4电荷的离子消失;DP增大到200 V时,携带3电荷的离子消失。携带2电荷的PEG最稳定,在不同DP情况下变化不大。相同碰撞能量（collision energy,CE）情况下,携带电荷数越多的PEG越容易被打碎,携带2电荷的离子不易打碎,且携带较多电荷的PEG离子的碎裂效率更高,形成子离子的响应也越高。本部分研究工作,将有助于后续实验中PEG多分散性药代动力学研究工作的进行,是后续实验的方法学基础。将以上方法进一步拓展,建立了一种测定分子量较大的PEG（20,000 Da）中,分子量较小的PEG杂质（PEG 750,2000和5000）的方法,该方法可用于高纯度PEG的质量监测。（2）PEG对P-gp外排功能的影响据文献报道,PEG在体外较高的浓度下具有抑制P-gp的作用。本部分采用过表达人P-gp的马丁氏犬肾上皮细胞（Madin-Darby Canine Kidney-human multidrug resistance protein 1,MDCK-hMDR1）建立细胞双向转运模型和细胞摄取模型,结果表明,在体外低浓度下,PEG仍具有抑制罗丹明123（rhodanmine123,Rho 123）、紫杉醇（paclitaxel,PAC）和秋水仙碱（colchicine,COL）等P-gp底物药外排的作用。这提示,在体外低浓度时PEG对P-gp也具有抑制作用。另外,通过大鼠分别给予PAC与PAC+PEG的对比药代动力学研究发现,PEG会显著增加PAC的体内暴露量。这说明,PEG极可能抑制肠道上的P-gp,产生基于P-gp的EDI。（3）PEG与P-gp相互作用机制既然PEG能够抑制P-gp的外排作用,本部分将对这一抑制作用是如何产生的进行深入的研究。结果发现,维拉帕米（verapamil,VER）和环孢素A（cyclosporin A,CsA）两种P-gp抑制剂的加入均能增加不同分子量PEG在MDCK-hMDR1细胞中的蓄积量。可见,不同分子量PEG均能被P-gp外排。一旦药物结合于P-gp的底物结合位点,必然会导致P-gp ATP酶（adenosine triphosphatase,ATPase）对ATP的水解供能,因此通过检测ATP的消耗,能够确证PEG是否结合于P-gp的底物位点。结果发现,不同分子量PEG的加入,均导致ATP消耗的增加,这证实了上面PEG结合于P-gp底物结合位点的推论。以上实验证实了PEG是P-gp的底物,即PEG对P-gp的抑制是通过其与P-gp的底物位点的竞争性结合实现的。（4）PEG进入细胞的机制传统认为,PEG具有较强的水溶性,因此无法进入细胞,其对P-gp的抑制是通过对细胞膜流动性的影响实现的。前面实验证明PEG能够进入细胞并与P-gp结合,因此本部分对不同分子量PEG进入细胞的机制及其多分散性过程进行了研究。结果发现,PEG 750和PEG 2000以被动扩散的方式进入细胞,其中分子量较小的PEG进入细胞较快,最开始细胞内PEG分子量分布轮廓会向小分子量端偏移,直到24 h细胞内PEG的分子量分布轮廓才逐渐与给药的PEG分子量分布轮廓一致。PEG 5000和PEG 20,000低浓度时是以被动扩散的方式进入细胞,但是随着浓度的升高,逐渐以被动扩散与小窝蛋白介导的胞吞相结合的方式进入细胞。随着浓度的升高,胞吞的比例逐渐升高,据推测这是由于随着PEG浓度的升高,会有部分团聚,团聚形态的PEG可能以胞吞的方式进入细胞,而游离的PEG仍旧是通过被动扩散的方式进入细胞。该结果可回答PEG 20,000对P-gp ATP酶的抑制作用为何在浓度较高时降低了,即团聚的PEG 20,000无法再与P-gp产生相互作用。通过以上结果可以推测,分子量较小的PEG是以被动扩散的方式进入细胞的,不需要能量,因此易通过被动扩散的方式排出细胞,这就是分子量较小的PEG不容易在组织蓄积的原因;而分子量较大的PEG可能形成团聚,团聚形态的PEG进入细胞后无法通过被动扩散排出细胞,只能通过一些供能过程排出细胞,因此有蓄积在组织中的风险。（5）PEG在大鼠体内的多分散药代动力学研究对PEG的体内多分散性药代动力学过程进行研究,结果表明,仅PEG 750可以采用口服的方式进入动物体内,PEG 750中分子量较小的PEG口服吸收比例更高。通过对PEG在体内的代谢研究发现,PEG 750会代谢为PEG酸,PEG2000会代谢为PEG 750,PEG 5000会代谢为PEG 500和PEG 1000,而PEG 20,000会代谢为PEG 500和PEG 2000。以上研究是PEG辅料在应用过程中的安全性问题的物质基础,为临床应用提供了理论依据,有助于提高该类药物的研发成功率,为其科学设计及安全性和有效性研究提供评价依据。