苹果再植病是一个复杂又难以解决的历史性问题,也是保障我国苹果产业可持续健康发展必须解决的问题。筛选抗重茬苹果砧木品种是目前防治苹果再植病最为环保且有效的途径。开展苹果砧木中参与调控抗再植病相关基因的筛选及作用机制研究,对于通过基因工程手段选育苹果再植病抗性砧木具有重要意义。以往研究表明,苹果再植病的关键发病因子主要是真菌,几丁质是真菌细胞壁的重要组成成分。模式植物研究结果显示,植物的几丁质受体蛋白可通过识别几丁质而触发植物的免疫反应,从而对随后的病原菌侵染表现出抗性。本研究借鉴了模式植物的研究成果,通过生物信息学分析,结合两个在苹果再植病抗性方面存在差异的品种(G.935与B.9)的转录组分析结果,成功获得了抗苹果再植病相关基因MdCERK1,并通过qPCR、pull-down及质谱测序等技术对该基因的表达特性及相互作用蛋白进行了筛选,获得了以下主要的研究结果:1.使用Pythium ultimum分别对两个在苹果再植病抗性方面存在差异的品种进行侵染,通过RNA-seq筛选差异表达基因来获得在苹果再植病抗病中起关键作用的目标基因。因为CERK(chitin elicitor receptor kinase)基因包含的胞外LysM(lysin motif)结构域,对几丁质的识别具有特异性。理论上,CERK基因对苹果再植病真菌性病原菌具有广谱抗性,具有很高的研究意义和应用价值,所以我们选择其作为进一步研究的目标基因。2.在利用qPCR研究基因表达时,需要内参基因对实验过程进行校正,而当前有关苹果根组织响应不同胁迫条件后的基因表达尚少有研究。所以我们利用了我们的转录组数据,选择了10个表达水平变化最小的基因和5个之前有过报道的内参基因。然后采用Delta Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper等分析方法对这15个基因在不同实验条件与不同基因型根组织中的稳定性进行了分析。结果表明,MDP0000095375、MDP0000147424、MDP0000233640、MDP0000326399和MDP0000173025等5个基因无论是非生物胁迫还是生物胁迫条件下都较为稳定,可以用作相关研究的内参基因。3.利用已公布的苹果基因组数据库GDR和The Apple Genome and Epigenome,鉴定苹果LysM基因家族成员。通过系统的鉴定,共得到30个苹果LysM家族成员。使用在线工具ExPASy Proteomics Server对MdLysM蛋白的基本信息进行预测。根据聚类分析可将这些基因分为A、B和C三组,且C组又可进一步被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个亚族,说明它们的功能可能已经发生了分化,基因结构的复杂程度与进化树聚类存在联系。MdLysM蛋白结构域预测的结果及基因结构分析的结果均与进化树聚类结果吻合。序列相似性及对MD09G1111800的基因组结构、结构域组成的序列分析以及其对外源几丁质的响应等结果显示,MD09G1111800是AtCERK1的同源基因,因此我们将其命名为MdCERK1。4.组织特异性表达分析显示,相比花、果实、种子等组织来说,MdCERK1还是主要在根、叶等营养组织中表达。立枯丝核杆菌侵染的苹果根组织中MdCERK1的转录调控模式证明,MdCERK1是一个功能性模式识别受体(pattern recognition receptor protein,PRR)。pull-down结果显示,GST-MdCERK1具有几丁质分子绑定能力,进一步从生化角度上证明了其就是苹果中的几丁质受体蛋白基因。其在不同抗性品种均能响应病原侵染,但是调控模式存在差异。5.使用pull-down联合质谱筛选到MdCERK1可能的互作蛋白PR4,进一步解析MdCERK1的抗病信号转导机制。综合以上所有的数据,得到结论,MdCERK1是一个几丁质绑定受体类激酶,主要在苹果营养器官中发挥作用,并且在响应苹果再植病病原菌侵染中发挥重要作用。