论文部分内容阅读
目的：观察颅脑损伤后经肠系膜静脉注射特定抗原免疫耐受建立的情况,初步探讨肝脏非实质细胞诱导免疫耐受的机制。方法：1.选取新西兰兔32只,随机分成4组,每组8只,依次命名为A-D组,A组为单纯颅脑损伤组,B组为注射1ml生理盐水组,C组为注射1mlMBP(2mg/ml)组,D组为注射1ml脑组织单细胞悬液组(细胞密度为106/ml)。1d四组均开颅造模,取0.8*0.4*0.5cm脑组织制备单细胞悬液；制备好脑组织单细胞悬液后在30min内开腹寻找肠系膜静脉,B组注射lml生理盐水。C、D组分别经肠系膜静脉分别注射1mlMBP和1ml单细胞悬液。7d全部处死,取损伤灶周围脑组织做Fas/FasL的定量PCR。2.选取20只SD大鼠,随机分为3组,对照组5只、假手术组5只和损伤组10只,损伤组按伤后时间分为2、4、8、16h和24h5个采血点,在伤后不同时间点采用眼眶取血法,取静脉血离心后得血清刺激原代培养的大鼠小胶质细胞,培养24h后流式细胞仪测定小胶质细胞MHC-Ⅱ的表达。·3.另选取新西兰兔24只,随机分成3组,每组8只,依次命名为E-G组,E组为注射1ml生理盐水组,F组为注射1mlMBP(2mg/ml)组,G组为注射lml单细胞悬液组(细胞密度为106/ml)。手术脑损伤造模、注射抗原同第一部分。分别于术后1d、3d、5d、7d、14d和21d抽取静脉血,做Elisa测血清中TGF-β,IL-2和IL-10的含量,21d处死,取肝脏组织做免疫荧光测定Foxp+3表达情况。结果：1.实时定量PCR显示：损伤后7d单纯颅脑损伤组和各处理组Fas均高表达,各组之间未见明显差异(p＞0.05)；A、B两组FasL未见表达增高,C组FasL表达显著升高,与A、B两组比较有统计学差异(p<0.05),D组表达略有升高,与A、B两组比较未见统计学差异(p＞0.05)。2.流式细胞结果显示：空白对照组MHC-Ⅱ微量表达;假手术组有较低表达；损伤组各个时间点均有表达,且随着时间的推移,MHC-Ⅱ表达增高。损伤组与对照组两两比较,差异有统计学意义(p＜0.05)。3.Elisa实验显示：与E组相比,F组TGF-β、IL-10显著升高,于14d左右到达高峰,随后缓慢下降,差异有统计学意义(p<0.05),IL-2相应减低,差异有统计学意义(p<0.05)；G组TGF-β、IL-10于10-14d可见略有升高,差异无统计学意义(p>0.05),IL-2未见明显减低,差异无统计学意义(p＞0.05)。4.免疫荧光化学显示：在注射生理盐水组和注射脑组织单细胞悬液组中,肝脏石蜡切片中T淋巴细胞未看到明显橙红色激发光。在注射MBP组中可看到静脉窦中和血管周围T淋巴细胞中可见橙红色荧光,说明注射MBP可使肝脏T淋巴细胞表达Foxp+3,与其他两组相比,有统计学差异(p<0.05)。结论：1.各处理组中,Fas在损伤后均高表达,说明损伤灶周围有大量淋巴细胞聚集,炎症反应强烈；经肠系膜静脉注射特定抗原并不能减少Fas的表达。肠系膜静脉注射MBP可以诱导免疫耐受；注射脑组织单细胞悬液的抗原特异性不高,不能完全诱导免疫耐受。2.大鼠脑损伤后24h内的血清可使小胶质细胞MHC-Ⅱ的表达增高,小胶质细胞MHC-Ⅱ表达随着时间的推移不断升高。从细胞水平支持了颅脑损伤早期炎症反应的剧烈程度。3.经肠系膜静脉注射MBP后,可见与E组相比,显著下降；而注射脑组织单细胞悬液组仅在14d才有下降,表明注射MBP可以诱导免疫耐受,而后者抗原特异性较差。4. TGF-β、IL-10均是强效免疫抑制因子,它们可以抑制细胞毒性T淋巴细胞的增殖和活化,抑制T,B淋巴细胞的增殖及免疫球蛋白的分泌。注射MBP比注射脑组织单细胞悬液更容易可以诱导免疫耐受。5.经肠系膜静脉注射MBP后,21d后,在荧光显微镜下显示,静脉窦及周围肝组织的T淋巴细胞呈橙红色荧光,说明其表达了Foxp+3,,侧面提示免疫耐受的成功建立。而在另外两组中,并未发现T细胞有橙红色荧光物质表达。说明脑细胞尚不能诱导Foxp+3的表达。