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青光眼是世界第一的不可逆性致盲性眼病,是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病,病理性眼压增高是其主要的危险因素。尽管其损害机制至今尚不完全明确,但大量研究表明眼压水平仍是影响青光眼性视神经损害的主要因素,眼压越高对视神经的损害越为严重。滤过性手术现今仍是临床上治疗青光眼主要的手术方式。术后五年滤过泡存活率不超过50%,其主要失败原因是滤过区组织发生过度瘢痕化反应。目前临床常在术中或术后联合应用药物丝裂霉素(Mitomicin C,MMC)或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)以抑制滤过道瘢痕化。但是这类抗代谢药物的细胞毒作用常常导致滤过泡渗漏、角膜上皮功能失调甚至迟发性眼内炎、黄斑变性等并发症。因此探索新的更加安全有效的抗瘢痕化药物具有重大意义。人结膜成纤维细胞(human conjunctival fibroblast,HconF)是存在于结膜下结缔组织内的具有分化功能的间叶细胞,正常状态下是静止的,手术或炎症等刺激因素激活HconFs并向肌成纤维细胞(Myofibroblasts,MFs)表型转化,启动伤口愈合反应。而HconFs表型转化为MFs是细胞纤维化、滤过道瘢痕化的重要细胞学基础。HconFs活化、聚集的最重要的细胞因子是转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β),在应急条件下,肥大细胞、成纤维细胞和炎症细胞分泌TGF-β,TGF-β与其受体结合,可以激活P38的磷酸化、Smad2和Smad3的表达及核转移。TGF-β一方面刺激细胞外基质合成,另一方面诱导HconFs向收缩性和活性更强的MFs转化。TGF-β表达于正常房水中,且在伤口愈合过程中结膜下TGF-β的三种单体的表达都有明显增高,外源性TGF-β也可诱导HconFs和MFs为主的细胞增殖、迁移和胶原收缩。针对TGF-β这一调控靶点的许多研究发现体内或体外抑制TGF-β都可有效抑制成纤维细胞纤维化、抑制瘢痕形成。我们的前期研究结果表明,TGF-β1可以促进HconF细胞增殖,促进HconF细胞由G1期进入S期和G2/M期,使MF细胞的标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达增加,促进HconF细胞迁移和细胞外基质合成,表明TGF-β1可促进人结膜成纤维细胞的纤维化,可以在体外很好地模拟青光眼滤过术后创伤愈合过程。维甲酸(retinoic acid RA)是维生素A的活性代谢产物,全反维甲酸(all-trans retinoic acid ATRA)是其中的一个亚型。ATRA在胚胎发育、生殖、视觉、细胞增殖、分化及凋亡以及炎症的过程中发挥着重要的生理作用。有研究表明,RA通过多种机制在肝纤维化、肾脏纤维化、肺组织纤维化等多种纤维化性疾病中发挥重要的作用,RA能够抑制细胞外基质形成,并且调节TGF-β信号传导通路。我们前期实验初步发现ATRA能够抑制TGF-β诱导的HTFs的细胞外基质的形成及细胞收缩,具有潜在的抑制结膜纤维化的作用。目的 应用ATRA作用于TGF-β1诱导的HconFs细胞,探讨ATRA抗纤维化作用及其机制,为探索新的更加安全有效的抗瘢痕化药物提供新的方向。方法(1)将ATRA作用于TGF-β1诱导的HconFs,利用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,采用细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移功能,采用Western blot方法检测细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及PI3K/AKT和磷酸化的PI3K/AKT的水平,分析ATRA对TGF-β1诱导的HconFs纤维化的影响及可能的机制。(2)建立兔眼滤过性手术模型,检测ATRA对兔眼小梁切除术后滤过道瘢痕化的影响。术前及术后测量眼压;术后利用眼前段照相观察滤过泡的形态及面积;四周后处死动物,完整摘取双眼眼球,采用免疫组织化学法检测滤过泡结膜组织中α-SMA、FN、collagen-Ⅰ、Fibrocectin、Smad2/Smad3及磷酸化的PI3K/AKT的表达,分析ATRA对青光眼滤过性手术滤过道瘢痕化的影响及可能的机制。(3)将PI3K抑制剂LY294002作用于TGF-β1诱导的HconFs,利用CCK-8法检测细胞活力,采用Transwell实验检测细胞的迁移功能,采用Western blot方法检测细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的水平。结果(1)发现ATRA能够抑制TGF-β1诱导的HconFs细胞的增殖,ATRA能够促进TGF-β1诱导的HconFs细胞的凋亡;证实ATRA能够抑制TGF-β1诱导的HconFs的迁移;ATRA能够抑制collagen-Ⅰ和fibronectin两种ECM蛋白的表达。由以上结果我们可以得出结论:ATRA能够抑制TGF-β1诱导的HconFs细胞的纤维化。进一步我们发现TGF-β1诱导的HconFs细胞PI3K/AKT磷酸化的水平能够被ATRA抑制,由此我们可以推测,ATRA调控HconFs细胞纤维化的过程,可能通过PI3K/AKT信号通路来实现的。(2)ATRA能够延长术后滤过泡的存活时间,能够降低滤过泡结膜组织中α-SMA、FN、collagen-Ⅰ、Fibrocectin、Smad2/Smad3及磷酸化的PI3K/AKT的表达,这与体外实验的结果一致,表明ATRA具有抑制青光眼滤过性手术术后滤过泡瘢痕化的作用,并且这一作用可能是通过调控PI3K/AKT信号通路来实现的。(3)PI3K抑制剂LY294002可降低TGF-β1诱导的HconF增殖;可降低TGF-β1诱导的HconF迁移;可减少TGF-β1诱导的细胞外基质fibronectin和collagen-I的合成。结论ATRA可以调控TGF-β1诱导的HConFs细胞迁移、增殖、转化和ECM合成过程;ATRA可能通过PI3K/AKT信号通路调控HConFs细胞的纤维化过程;ATRA能够抑制兔眼滤过术后滤过泡的瘢痕化。PI3K抑制剂LY294002能够抑制HConFs细胞的纤维化;提示ATRA可能会成为一种新的抗滤过泡瘢痕化的药物,PI3K/Akt信号通路可能成为对抗滤过泡瘢痕化的一个新靶点。