本论文共分七章内容。一、文献研究本部分是在对相关文献进行整理的基础上,系统综述了我国鹿科药用动物角类药材的研究概况,我国麋鹿生物资源的药用历史考证与现代研究,以及麋鹿生物资源的保护与利用现状,在此基础上提出了本论文的研究思路与实验方案。二、麋鹿角资源化学分析评价研究(一)核苷及碱基类成分资源化学分析评价采用HILIC-UHPLC-TQ-MS/MS技术,测定了麋鹿角及鹿角中17种核苷及碱基类成分。结果显示:(1)总核苷含量因鹿龄和角部位不同差异较大,最高的是2岁龄尖部,达49.7 μg/g,最低为3岁龄尖部,仅为5.97 μg/g。3个部位平均总含量最高的是2岁龄,可达28.6μg/g,与马鹿角接近,其次为5岁龄,6-8岁龄,3岁龄,最低的是4岁龄,仅为9.63μg/g。(2) 2岁、6-8岁龄角部位中核苷及碱基总含量从尖部、中部、基部依次递减,这与鹿茸骨化成角的变化趋势相一致。(3)麋鹿角中主要含有黄嘌呤、次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤及鸟苷(>70%)等,脱氧核苷(2’-脱氧肌苷、2’-脱氧尿苷、胸苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧腺苷、2’-脱氧胞苷)、腺嘌呤及腺苷类成分含量较低。(二)氨基酸类成分资源化学分析评价采用HILIC-UPLC-TQ-MS/MS技术,建立了快速、灵敏,且不经衍生化直接发现并测定24种游离氨基酸类成分的分析方法,测定了样品中游离氨基酸类成分,包括8种必需氨基酸与5种非蛋白氨基酸。结果显示:(1)游离氨基酸含量因鹿龄及角部位不同存在较大差异。最高的为6-8岁龄尖部,达1.68mg/g,最低为3岁龄尖部,仅为0.305mg/g。3个部位平均总含量最高者为6-8岁龄,含量可达1.18mg/g,与2岁龄接近(1.12mg/g);其次是5岁龄(0.880mg/g), 3岁和4岁龄含量最低,分别为0.671mg/g和0.644mg/g。(2) 3、4岁龄麋鹿角及新疆马鹿角中总氨基酸含量从基部到尖部依次递减,呈下降趋势。(3)麋鹿角中主要含有苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸及赖氨酸(>89%)等,色氨酸、甲硫氨酸、γ-氨基丁酸、羟脯氨酸及谷氨酰胺等含量较低。(4)除19种组成蛋白质氨基酸外,在样品中还检测到非蛋白氨基酸:γ-氨基丁酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、牛磺酸及鸟氨酸。(三)无机元素资源化学分析评价采用微波消解制样,ICP-AES法测定了包括Se、Mo、Zn、Ni、Fe、Si、Mn、Cr、Cu、Sr等10种人体必需微量元素,Ca、P、K、Na、Mg等5种人体必需宏量元素在内的共29种无机元素。结果显示:(1)所有样品中均检测到 Ca、K、Na、P、Se、Sr、Pb、Si、Mo、Zn、Sb、Bi、Cd、Ni、Ba、Fe、Mn、Cr、Mg、Cu及A1共21种元素,包括Pb、Sb、Cd等对人体有害元素;未检测到Sn、As、Co、B、Hg、V、Ti及Zr8种元素。(2)5种宏量元素的含量均与马鹿角接近,其中以Ca、P的含量为最高,分别达24.36%和10.85%;必需微量元素中Zn、Fe、Si、Sr含量较高。除Fe、Si、Mn、A1外,麋鹿角不同部位其它元素含量差异不明显。(3)元素相关性分析显示,麋鹿角中共有36对元素呈显著正相关,表明这些元素间具有相互协同、促进吸收的关系。(四)多糖类成分资源化学分析评价分别采用Elson-Morgan法、硫酸咔唑法及苯酚硫酸法,以氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖为对照品,测定了样品中的氨基己糖、酸性多糖及中性多糖。结果显示:(1) 3种多糖含量因鹿龄和角部位存在较大差异。3种多糖总含量以2岁龄麋鹿角为最高,可达3004 μg/g;其次为5岁龄,为2006 μg/g,与6-8岁龄含量接近;3、4岁龄相对较低,分别为1252 μg/g和1120μg/g。(2) 3种多糖在3个角部位的平均含量均以2岁龄麋鹿角为最高,其中氨基己糖和中性多糖含量与宁夏马鹿角接近,酸性多糖低于宁夏马鹿角。(3)不同鹿龄麋鹿角中均以中性多糖含量为最高,平均含量可达1044 μg/g,其次是氨基己糖,含量为452.9μg/g,酸性多糖含量相对较低,为339.7μg/g。三、麋鹿角补阴功效生物活性评价研究(一)麋鹿角对甲状腺素并利血平致小鼠肾阴虚模型作用研究采用甲状腺素并利血平致小鼠肾阴虚模型,以麋鹿角不同样品给药,测定体质量变化,脾脏、肾脏和胸腺指数,以及肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)水平,血浆中白细胞介素-2 (IL-2)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平,研究麋鹿角补阴作用。结果显示,麋鹿角粉和水提药渣均能显著升高模型小鼠脾脏指数,降低肾脏指数,升高肝脏组织中SOD和GSH-Px活性并降低MDA水平,降低血浆中TNF-α水平;水提取物也能降低肾脏指数,升高肝脏中SOD和GSH-Px活性,同时降低MDA水平。麋鹿角粉、水提取物及水提药渣均能在一定程度上改善小鼠阴虚症状,其补阴功效与调节机体抗氧化能力、内分泌和免疫系统等功能状态密切相关。(二)麋鹿角对甲状腺素并利血平致大鼠肾阴虚模型作用研究采用甲状腺素并利血平致大鼠肾阴虚模型,以麋鹿角水提取物和水提药渣给药,测定脾和胸腺指数,以及血浆中皮质醇(Cort)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、促肾上腺皮质激素(ATCH)、促甲状腺激素(TSH)、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、免疫球蛋白G (IgG)和免疫球蛋白M (IgM)水平,研究麋鹿角补阴作用机理。结果显示,麋鹿角水提取物及水提药渣均能显著升高大鼠脾脏指数,显著降低异常升高的E2水平和cAMP/cGMP比值(P<0.05),并显著升高异常降低的cGMP和IgG水平(P<0.05或<0.01);麋鹿角水提取物还能显著升高T和ACTH水平。麋鹿角补阴作用与调节机体内分泌-免疫网络功能密切相关。四、麋鹿角益精血功效生物活性评价研究采用环磷酰胺并乙酰苯肼致小鼠化学损伤性血虚模型,以麋鹿角不同样品给药,测定小鼠体质量变化、外周血常规、骨髓细胞周期以及脾脏病理检查等,研究其益精血作用。结果显示,麋鹿角粉及麋鹿角水提药渣低、中剂量组均对降低的WBC有恢复作用,麋鹿角水提取物对RBC也有改善的趋势。麋鹿角水提取物及其药渣均能促进骨髓细胞由G0/G1期向S期转化,促进骨髓细胞DNA的合成,促进造血祖细胞的增殖。麋鹿角水提取物具有改善模型小鼠脾脏病变的作用。麋鹿角对化学损伤性血虚模型小鼠有一定的保护作用。五、麋鹿角抗衰老作用生物活性评价研究(一)麋鹿角对D-半乳糖诱导小鼠亚急性衰老模型作用研究采用D-半乳糖诱导的小鼠亚急性衰老模型,以麋鹿角不同样品给药,检测血浆中白细胞介素-2 (IL-2)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平,肝、肾和脑中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量,脑中单胺氧化酶(MAO)活性,小鼠背部皮肤羟脯氨酸(Hyp)含量,以及胸腺和脾脏指数,研究麋鹿角抗衰老作用。结果显示,麋鹿角粉和水提取物均能显著提高衰老小鼠肝脏、肾脏以及脑组织内过低的SOD活性,提高肾脏和脑组织内过低的GSH-Px活性;同时降低肝脏和脑组织内过高的MDA水平,抑制脑组织中过高的MAO活性,显著升高过低的脾脏和胸腺指数;显著升高小鼠背部皮肤中降低的Hyp含量。水提取药渣也能显著提高肾脏中SOD和GSH-Px活性,抑制脑组织内MDA水平和MAO活性,升高背部皮肤中Hyp含量和胸腺指数。结果表明麋鹿角粉、麋鹿角水提取物以及水提药渣均有较好的抗衰老作用,麋鹿角可通过提高机体抗氧化酶系活性,抑制脑组织中MAO活性,提高免疫功能,延缓皮肤衰老而发挥抗衰老作用。(二)麋鹿角对果蝇寿命的影响采用黑腹果蝇模式生物,以麋鹿角水提取物给药,以果蝇的半数死亡时间、平均寿命和平均最高寿命为指标,评价麋鹿角对果蝇寿命的影响。结果显示,麋鹿角水提取物能明显增加果蝇的半数死亡时间、平均寿命和平均最高寿命,显示出麋鹿角具有较好的延缓衰老作用。六、麋鹿角强筋骨功效生物活性评价研究(一)麋鹿角对摘除卵巢致大鼠骨质疏松模型作用研究采用切除卵巢致雌性大鼠骨质疏松模型,以麋鹿角不同样品给药,测定大鼠体质量变化,子宫脏器指数,血清钙(Ca)、磷(P)、镁(Mg)及碱性磷酸酶(AKP)水平,股骨骨密度(BMD)和骨矿物质含量(BMC)等,研究其强筋骨作用。结果显示,麋鹿角粉、水提取物及药渣均能显著提高大鼠血清中P水平;麋鹿角粉低剂量和药渣高剂量能显著提高BMD和BMC,升高血清AKP水平;水提取物高、低剂量均能升高血清AKP水平,高剂量组也能提高BMD。综合作用来看,麋鹿角粉低剂量的作用强于高剂量,而水提取物和药渣高剂量的作用强于低剂量。麋鹿角粉、水提取物和水提药渣均具有一定的抗骨质疏松作用。水溶性成分和药渣中的雌激素类成分可能是麋鹿角抗骨质疏松作用的活性成分。(二)麋鹿角对泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松模型的作用研究采用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型,以麋鹿角总水提取物及其不同分子量段MW>100kDa、10kDa<MW<100kDa、3kDa<MW<10kDa、MW<3kDa 和乙醇提取物为试验样品,斑马鱼以茜素红荧光染色,根据数码影像中斑马鱼头部骨骼染色区域面积及累计光密度(IOD)值,应用专业图像分析软件进行定量分析,研究麋鹿角抗骨质疏松作用。结果显示,麋鹿角总水提取物及其不同分子量段均具有一定的增加斑马鱼头部骨骼骨矿化量和骨密度的作用,显示出较好的阻止斑马鱼骨量丢失作用;95%乙醇提取物仅显示出一定的阻止斑马鱼骨量丢失趋势。推测水提取物是麋鹿角抗斑马鱼骨质疏松的活性部位,麋鹿角中含有的蛋白、多肽及多糖等水溶性大分子成分和氨基酸、无机元素、核苷及碱基等水溶性小分子成分可能是主要活性物质。(三)利用MG63-ERE稳转细胞筛选麋鹿角不同提取物拟雌激素样作用研究选择MG63-ERE稳转细胞作为受试细胞,以麋鹿角总水提取物及其不同分子量段MW>100kDa、10kDa<MW<100kDa、3kDa<MW<10kDa、MW<3kDa 和乙醇提取物为试验样品,用雌二醇作为阳性对照,检测Luciferase荧光素酶报告基因的表达水平,筛选麋鹿角不同提取物的拟雌激素样活性作用。结果显示,麋鹿角95%乙醇提取物和水提取物1OkDa <MW <100kDa、3kDa <MW <10kDa 和 MW <3kDa 分子量段均能显著增强 MG63-ERE中荧光素酶表达,具有显著的拟雌激素样作用;其中95%乙醇提取物和3kDa<MW<10kDa分子量段具有明显的量效关系。七、基于COI条形码序列的角类动物药材DNA分子鉴定研究采用DNA条形码技术,对源自鹿科、牛科和犀科的7种角类动物药材共计11个样品进行分子鉴定。利用通用引物LCO1490/HCO2198成功的进行了 PCR扩增,获得了 7种角类动物药材的COI条形码序列。通过多序列比对,分析比较属间、种间及种内变异及遗传距离,建立了系统发育树。通过系统发育树的聚类情况可以看出,各物种基本以科的分类聚在一起,各物种又形成相对独立的支,支持率较高,可以明确地将各物种区分开;其中牛科的藏羚羊与鹿科聚在一起,犀科的广角与牛科的水牛角及牦牛角聚在一起,显示出较近的遗传关系。获得的正品来源COI序列为准确鉴定各角类动物药材奠定了基础,系统发育树中显示的犀角与水牛角更近的遗传关系为水牛角作为犀角替代资源的应用提供了科学依据。