樟芝高效合成Antroquinonol发酵体系构建及其机制解析

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Antroquinonol是从樟芝固态发酵产物中分离得到的一种具有广谱抗癌活性的化合物,但是固态发酵固有的缺陷以及较低的产量限制了其在临床的应用。虽然多种前体物被证明在液态发酵中具有诱导Antroquinonol产生的作用,但是Antroquinonol的产量依旧处于一个较低的水平。本论文通过萃取剂的筛选、萃取发酵体系的优化,建立了用于高效合成Antroquinonol的In-situ萃取发酵系统,并建立了Antroquinonol提取纯化工艺。通过对细胞形态、细胞通透性以及细胞膜分析,解析了萃取剂对樟芝菌丝体及Antroquinonol渗出的影响;基于转录组学、蛋白质组学、同位素标记等实验,结合Antroquinonol合成关键基因功能验证,从分子水平解析了前体物辅酶Q0诱导Antroquinonol合成机制,为高效定向获得此类化合物奠定基础。主要研究结果如下:(1)根据萃取剂的萃取能力、生物相容性、log P值以及Antroquinonol结构特征,选择了正十四烷、正癸烷、重石蜡、轻石蜡、油酸等九种有机溶剂作为萃取剂。通过对比分析九种萃取剂对Antroquinonol产量、生物量、代谢物种类和樟芝S-29菌丝体形态的影响,筛选出两种最优的萃取剂,即油酸和正十四烷。通过优化萃取剂添加量、添加时间以及前体物辅酶Q0添加量,确定最优发酵参数为:萃取剂添加时间为发酵第3天;萃取剂添加量20%(v/v);前体物辅酶Q0添加量0.3g/L。Mini-scale-up萃取发酵实验表明,当正十四烷作为萃取剂时,Antroquinonol最大产量是146.1±2.8 mg/L,为对照组的7.4倍;当油酸作为萃取剂时,Antroquinonol和Antrodin C产量分别提高了5.4倍和8.1倍。In-situ萃取发酵体系显著提高了发酵液中氧含量,从而使樟芝的生物量得到显著改善。采用成本低廉且易于操作的硅胶固相萃取短柱,实现了Antroquinonol等代谢产物的高效富集,并达到萃取剂相纯化回收的目的。通过以正己烷和乙酸乙酯为流动相的硅胶柱层析法,实现了Antroquinonol等生物活性物质的分离纯化。(2)通过对樟芝S-29真核有参转录组测序中差异表达基因统计分析发现In-situ萃取发酵体系中大量差异表达基因参与次级代谢产物的生物合成、运输和分解代谢过程。通过KEGG对差异表达基因所富集的代谢通路分析发现,以正十四烷和油酸为萃取剂的In-situ萃取发酵体系中脂肪酸的生物合成途径均显著富集。参与此途径的基因(FAD2、fab G和SCD)均显著上调。通过GC/MS测定细胞膜脂肪酸含量发现,In-situ萃取发酵体系中樟芝S-29细胞膜中油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)的含量显著增加。采用透射电镜对樟芝S-29细胞观察发现,细胞膜电子密度随着萃取剂的加入而发生了明显的变化。细胞通透性测定结果表明,以正十四烷和油酸为萃取剂的In-situ萃取发酵体系中细胞膜透性分别提高22.9%和24.6%。因此,In-situ萃取发酵体系中樟芝对萃取剂的适应性以及Antroquinonol等代谢产物的渗出机制为:樟芝在萃取剂的压力下,调控细胞膜中油酸和亚油酸合成相关的基因FAD2和SCD表达量显著增加,导致细胞膜中不饱和脂肪酸的含量显著提升,进而增加了其通透性。在In-situ萃取发酵过程,Antroquinonol等代谢产物顺利通过细胞膜转移到萃取剂相,从而减少了樟芝细胞中代谢产物反馈抑制,提高了Antroquinonol等活性物质的产量。(3)通过对差异表达基因的鉴定和GO功能聚类分析发现,添加前体物辅酶Q0导致大量基因参与代谢过程。利用KEGG富集通路分析对差异表达基因参与的代谢途径进行细化,发现泛醌和其他萜类醌生物合成途径显著富集。通过i TRAQ蛋白质组差异表达蛋白质GO和KEGG富集分析表明,在蛋白质水平上此代谢通路也显著富集。因此,初步确定Antroquinonol生物合成途径与泛醌和其他萜类醌生物合成途径相类似。采用蛋白质组和转录组数据联合分析查找可能参与Antroquinonol生物合成的关键基因和关键酶。通过基因功能分析和q-PCR再次验证,最终确定ubi A和Co Q2基因可能在Antroquinonol合成过程中发挥了重要作用。通过同位素标记技术结合LC-MS/MS分析表明,在辅酶Q0诱导发酵过程中Antroquinonol生物合成的中间代谢产物为辅酶Q3。初步确定了Antroquinonol的生物途径为:外界添加辅酶Q0诱导樟芝中ubi A和Co Q2表达量增加,辅酶Q0与樟芝中甲羟戊酸途径合成的FPP在ubi A和Co Q2编码的4-羟基苯甲酸酯聚异戊二烯基转移酶的作用下形成中间代谢产物辅酶Q3。辅酶Q3利用NADH转化为NAD+释放的两个电子,完成一个双键的消除和一个酮基的还原,最终形成Antroquinonol。(4)通过对酶的类型、酶解时间、菌龄、渗透压稳定剂的种类和浓度等进行了优化,确定产生原生质体的最佳条件为:4天菌龄的樟芝S-29菌丝体以1.0 M Mg SO4为渗透压稳定剂,在20 mg/m L的混合酶(溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶)作用下酶解4 h。优化了樟芝S-29 PEG-Ca Cl2介导的遗传转化体系,并利用此体系将基因过表达质粒p CT74-gpd-ubi A和p CT74-gpd-Co Q2成功导入樟芝S-29中,实现了ubi A和Co Q2基因的过表达。采用Split-marker敲除方法,分别构建p AN7-ubi A-5’、p AN7-ubi A-3’、p AN7-Co Q2-5’和p AN7-Co Q2-3’敲除质粒,实现了ubi A和Co Q2基因的敲除,得到了Δubi A基因敲除突变株和ΔCo Q2基因敲除突变株。对突变株分别进行发酵,测定相关基因表达量、Antroquinonol产量和生物量。ubi A和Co Q2基因过表达显著增加了Antroquinonol产量。对ubi A和Co Q2基因敲除后,Antroquinonol产量受到显著影响。通过4-羟基苯甲酸酯聚异戊二烯基转移酶合成相关基因的功能验证,进一步确定ubi A和Co Q2基因在Antroquinonol合成具有关键作用。
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