背景1917-1919年,欧洲爆发流感疫情,又称西班牙流感,导致全球2000万人死亡,是历史上最严重的流感疫情。1957-1958年,中国爆发流感疫情,其后扩散至世界各地,又称亚洲流感,造成全球100万人死亡;1968-1969年,香港爆发流感疫情,导致全球约70万人死亡。2009年,一种新型的三源重配的甲型H1N1流感病毒先后在墨西哥和北美爆发,随后蔓延至世界各地,最终造成全球超过28万人死亡。2009年的这次流感疫情中,感染人群以中青年为主,65岁以下的感染人群比例占80%,而孕妇作为流感病毒的易感人群而受到了广泛关注。因此,国际免疫接种实施顾问委员会建议孕妇接种灭活的甲型H1N1流感疫苗来预防病毒感染。值得注意的是,中国的孕妇接种流感疫苗的覆盖率较低。虽然甲型H1N1流感病毒大爆发已经得到很好的控制,然而流感病毒其他亚型,如高致病性H5N1、H7N9流感病毒均在人群中持续性或散在性爆发,呈卷土重来之势,严重威胁人类健康。遗憾的是,中国孕妇接种流感疫苗覆盖率偏低,而婴幼儿及成年人精神疾病发病率逐年升高(2010年,15%,大约1.7亿人),排除遗传因素的影响,虽然二者是否存在内在的联系还不清楚。但是研究表明未接种流感疫苗的孕妇感染流感病毒的概率明显比接种流感疫苗孕妇的感染率高,这可能是近年来精神疾病发病率逐年升高的一个解释。近年来,随着脑认知与脑疾病研究的逐渐深入,脑和脊髓已不再认为是“免疫豁免器官”。越来越多的研究表明,外周适应性免疫状态的改变对海马神经发生和认知功能产生深远的影响,近年来的机制研究主要集中在免疫因子和免疫细胞上。适应性免疫反应改变外周免疫因子水平,激活单核巨噬细胞或者t淋巴细胞,激活的t淋巴细胞和单核巨噬细胞被募集到外周与中枢临界处-脉络膜。因为脉络膜由疏松的血管细胞和脉络膜上皮细胞构成,通透性较强,所以允许外周免疫细胞在不破坏血脑屏障的前提下渗透入脑脊液和脑膜。最终通过释放免疫因子,如il-10,il-4等调节神经发生和行为功能。本实验室前期的研究已经证实,孕期接种甲型h1n1流感疫苗促进孕鼠海马神经发生和工作记忆能力,我们提出外周免疫状态的改变,上调脑内生长因子bdnf及igf-1的水平,降低脑内炎症因子的表达,在脑内形成一个有利于神经元生长、存活的微环境,最终提高认知功能。然而,外周免疫状态的改变如何调节脑内的微环境,其潜在的机制还不清楚。因此,本课题在已有的研究基础上,采用激光共聚焦拍摄技术,脑立体定位注射技术,荧光定量pcr以及流式细胞术等方法,旨在探讨外周适应性免疫是通过哪些调节因子和免疫细胞影响脑认知功能的,即外周调节中枢的中间环节是什么。为探讨孕期接种甲型h1n1流感疫苗促进神经发生及工作记忆能力提供坚实的理论基础。也为孕期接种流感疫苗的安全性提供实验数据。研究方法1.实验动物与免疫接种8周龄的c57bl/6孕鼠(spf级),通过检查阴栓获得准确妊娠时间,随机分为6组,每组6-10只。在妊娠早期(第2.5天),其中两组分别股四头肌接种灭活的甲型h1n1流感疫苗(pre+aiv),剂量为3μg/只,对照组注射等量无菌pbs(pre)。甲型h1n1流感疫苗购买于广东省疾病预防控制中心,疫苗剂剂量参照本实验已经发表的文章。所有动物均饲养于中山医学院实验动物中心spf级小鼠房。血凝抑制试验(hi)检测血清抗体滴度,于接种前和接种后第14天,通过尾尖采血的方法收集血清,检测流感疫苗组的血清抗体滴度水平。按不同稀释倍数稀释待测血清,能完全抑制红细胞凝集(4hau)的最大稀释倍数即为该血清的抗体滴度。3.免疫荧光染色与体视学细胞计数免疫荧光法观察脉络膜、侧脑室和第三脑室脑膜的t淋巴细胞(tcr+),胚胎14天孕鼠腹腔注射3次5-溴脱氧尿苷(brdu,50mg/kg,每2h注射1次;sigma-aldrich),末次brdu注射后2h免疫荧光染色观察细胞增殖(brdu+)、神经前体细胞(tbr2+)、未成熟的神经元(dcx+)、神经干细胞(nestin+)、胶质细胞增殖(brdu+/iba-1+,brdu+/gfap+)、神经元分化(brdu+/neun+)、脑源性神经营养因子(bdnf)以及胰岛素样生长因子1(igf-1)表达量的变化。4.中和抗体及米诺环素注射4.1脑立体定位胚胎7天的疫苗组的孕鼠麻醉后被固定于脑立体定位仪上,采用微量注射器向侧脑室内单次注射2μl抗tcr中和抗体(50μg/kg;acrisantibodies,clonekj12-98)和等量的同型对照igg2a抗体。采用渗透性泵(alzet,model2004)向侧脑室渗入抗bdnf抗体、抗igf-1抗体(50μg/kg,抗bdnf抗体,渗透率1.0μl/h;抗igf-1抗体,渗透率2.0μl/h)以及同型对照igg抗体,渗透持续时间7天(胚胎7天-胚胎14天)。侧脑室定位坐标为:前囟后1.0mm,中缝旁开0.75mm,脑膜至腹侧进针深度2.5mm。注射时间为5min,留针5min。4.2尾静脉注射抗cd4中和抗体为了抑制外周血t淋巴细胞的功能,腹腔注射抗体cd4中和抗体(sigma-aldrich,0.1%bsa/pbs1:5稀释)及同行对照igg抗体。采用流式细胞术的方法检测外周血cd4阳性t淋巴细胞数量的变化。2.流感疫苗接种后机体体液免疫的变化5.实时定量聚合酶链式反应(rt-pcr)采用trizol抽提脉络膜组织和小胶质细胞的总rna,goscripttmcdna反转录2μg信使rna后获得cdna文库。采用transstarttipgreenqpcrsupermix半定量vcam-1、icam-1、cxcl9、cxcl10、ccl5、ifn-γ、il-4、tnf-1、il-6mrna表达水平。cdna的扩增和基因的定量均在bio-radiq5聚合酶链式反应仪上进行。6.酶联免疫吸附试验(elisa)检测孕鼠海马神经营养因子水平胚胎14天孕鼠分离海马组织,双抗体夹心法检测对照组、流感疫苗组以及流感疫苗接种后各中和抗体处理组海马组织匀浆中bdnf以及igf-1表达量的变化。7.伊文思蓝(evensblue)注射流感疫苗接种后第7天,孕鼠腹腔单次注射0.2ml伊文思蓝(sigma-aldrich,0.9%生理盐水配制2%evensblue溶液)。3h后心脏灌注预冷的0.9%生理盐水,取脑组织在二甲基甲酰胺溶液中高速匀浆,离心取上清,采用酶标仪检测血脑屏障通透性变化。8.原位末端标记法(tunel)分析和定量细胞凋亡检测胚胎14天孕鼠海马颗粒层凋亡细胞情况,采用deadendtmfluorometric细胞凋亡试剂盒(promega,usa)。随机选取一系列5张脑片统计阳性细胞数量,作为一只动物的统计数据。每组4只小鼠。9.八臂迷宫行为学检测胚胎11到18天,八臂迷宫检测对照组、流感疫苗组、流感疫苗接种联合抗tcr中和抗体组的孕鼠工作记忆能力和参考记忆能力。研究结果1.流感疫苗接种后机体体液免疫的效应观察接种前,流感疫苗组和对照组的抗体滴度均处于基线水平。而接种后第14天,流感疫组抗体滴度水平与对照组比显著性升高(p<0.001),血清hi抗体滴度达到:1:152。2.t淋巴细胞染色,神经发生,胶质细胞表型及营养因子表达变化流感疫苗组的孕鼠脉络膜、侧脑室脉络膜及第三脑室脑膜处可染色到tcr+的t淋巴细胞,而对照组的孕鼠在以上部位冠状切面几乎检测不到t细胞。胚胎14天,疫苗组的孕鼠侧脑室svz及齿状回dg区的brdu+细胞数量较对照组均显著增多(p<0.05),齿状回dg区未成熟的神经元(dcx+)及神经干细胞(nestin+)数量较对照组明显增多,7天后新生的小胶质细胞(brdu+/iba-1+)和星形胶质细胞数量(brdu+/gfap+)与对照组相比,没有统计学差异(p>0.05)。28天后新生的成熟的神经元(brdu+/neun+)数量较对照组要显著增多(p<0.05)。然而,流感疫苗组的孕鼠dg区很多小胶质细胞表达胰岛素样生长因子(igf-1);流感疫苗接种组脑源性神经营养因子(bdnf)的水平较对照组也显著升高(p<0.05)。3.调节t淋巴细胞功能对孕鼠神经发生及认知功能的影响胚胎7天,侧脑室立体定位注射抗tcr中和抗体,阻断t细胞功能。发现阻断脉络膜t淋巴细胞功能可以逆转流感疫苗引起的神经增殖(brdu+、dcx+、tbr2+)的增加,使其下降到对照组水平;同时降低流感疫苗组孕鼠的工作记忆能力,具有统计学意义(p<0.05)。胚胎2.5天和7天,2次尾静脉注射抗cd4抗体,下调外周血t细胞功能。发现下调外周血t细胞功能同样可以逆转流感疫苗引起的神经增殖(brdu+、dcx+、tbr2+)的增加(p<0.05)。4.脉络膜上皮细胞粘附分子,趋化因子及细胞因子的表达变化荧光定量pcr检测的结果显示,与对照组相比,流感疫苗组脉络膜细胞内粘附分子、血管内皮粘附分子、趋化分子ccl5、cxcl9、cxcl10mrna表达水平在胚胎7天、14天、21天均有不同程度的升高,具有统计学意义,表现为先升高后下降的趋势。而脉络膜细胞因子中ifn-γ、il-4的表达量在胚胎7天、14天、21天与对照组相比均明显升高,并且前者持续升高,后者先升高后下降。流感疫苗组的孕鼠炎症细胞因子tnf-a和il-6在胚胎7天较对照组显著升高(p<0.01),而在胚胎14天、21天较对照组相比明显下调(p<0.05)。5.流感疫苗对海马小胶质细胞m1/m2极化的影响荧光定量pcr检测显示:流感疫苗组的孕鼠海马小胶质细胞向m2型极化,与对照组相比,表现为arg1(精氨酸酶)和ym1(几丁质酶,又称chi3l3)基因的表达量显著增加(p<0.001);而小胶质细胞m2极化可被抗tcr中和抗体和米诺环素阻断。6.流感疫苗对海马内bdnf和igf-1表达的影响elisa法检测流感疫苗组和对照组海马内bdnf和igf-1表达水平,发现前者bdnf和igf-1的表达量显著高于后者,具有统计学意义(bdnf,p<0.05;igf-1,p<0.01)。7.中和抗体及米诺环素对海马神经元凋亡的影响tunel法检测流感疫苗组和对照组海马神经元凋亡水平,发现抗tcr中和抗体和米诺环素干预组与其相应的对照组相比,海马神经元凋亡水平无显著性差异(p>0.05)。结论1.孕早期接种流感疫苗可募集外周T淋巴细胞到脉络膜,有利于海马神经发生和工作记忆能力的提高2.孕早期接种流感疫苗上调脉络膜上皮细胞趋化分子、粘附分子的表达3.脉络膜T淋巴细胞促进海马神经元分泌BDNF;小胶质细胞向M2型极化,并分泌IGF-1;上调细胞因子IL-4,IFN-γ水平,下调TNF-a和IL-6水平;最终形成一个有利于神经增殖的微环境4.孕早期接种流感疫苗促进孕鼠海马神经发生和工作记忆能力