论文部分内容阅读
谷胱甘肽(GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种含有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽。GSH具有多种重要的生理功能。微生物发酵法是目前生产GSH最常用的方法,选用的菌种多为酵母。从自然界中筛选到98株产还原型谷胱甘肽的酵母菌。其中2株(2053#和ALJ036) GSH的产量相对较高,2053#和ALJ036总GSH含量在发酵30 h时达到最大值49.7 mg/L和38.7 mg/L。2053#菌株与假丝酵母菌属中Candida Parapsilosis的18S rDNA基因序列同源性高达99.75 %,结合常规生理生化鉴定结果,说明2053#是Candida Parapsilosis的一个亚种,其18S rDNA基因序列在GenBank数据库中的登陆号为DQ218328。而另一株酵母ALJ036菌株经生理生化试验及18S rDNA鉴定为Saccharomyces cerevisiae,其干细胞GSH含量达到了7.2 mg/g。利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthas)编码基因gsh 1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastoris x-33,构建了重组菌Pichia pastoris x-33(pGAPZA-gsh 1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并采用PCR的方法进行验证。对阳性转化子的γ-glutamyl-cysteine synthas酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-glutamyl-cysteine synthas的酶活力是宿主菌的2.99倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42 .2 mg/L,是宿主菌的1.6倍。考察了培养基及培养条件对重组酵母合成GSH的影响:碳源和氮源的选择及其浓度的优化,磷酸盐的影响,前体氨基酸的影响。优化后的培养基组成为:甘油30 g/L、蛋白胨40 g/L、酵母膏9 g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH2PO4 3 g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200 r/min、装液量为30 mL/250mL、接种量为10 %。在此优化条件下重组酵母的生物量达到最大值19.6 g/L, GSH产量是98.5 mg/L,为优化前的2.33倍。在5 L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后重组菌的生物量、GSH产量分别为18.7 g/L,97.9 mg/L,与摇瓶发酵结果基本吻合。