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随着凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖业的规模化发展,其病害的威胁也日益增大,对其病害的防控目前主要以预防为主,防治结合。因此,在养殖生产过程中及时监测虾体携带病原的状况,并科学地运用生态防控技术,这对保障养殖生产效益,促进产业的健康发展具有重要意义。对此,本研究旨在针对养殖对虾虾红细胞虹彩病毒(SHIV)、肝肠胞虫(EHP)、副溶血性弧菌(VPAHPND)、白斑综合症病毒(WSSV)以及传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)等主要的五种常见病原,优化建立一种可同时检测多种病原的多重巢氏PCR(Multiplenested PCR,MNPCR)检测方法,为后续进一步优化和集成养殖对虾病害生态防控技术提供技术支持。本研究首先采用单种病原的PCR检测技术对2017-2018年广东省茂名市和汕尾市的对虾养殖主产区的凡纳滨对虾样品开展SHIV、EHP和VPAHPND等三种病原的感染情况调查分析,结果发现养殖对虾中SHIV、EHP和VPAHPND均有检出,其中SHIV和EHP的阳性率较高,分别为23.81%、23.13%,VPAHPND检出率相对较低,为3.40%。此外,在采集的池塘水和水源水样品中亦均检出SHIV、EHP和VPAHPND,其中,SHIV阳性率为 30.43%和 44.00%,EHP 为 47.83%和 36.00%,VPAHPND 为 4.35%和 4.00%。而在所放养的虾苗中偶尔可检出一定量的VPAHPND;在幼虾饵料生物——丰年虫卵中检测发现其亦具有一定的EHP和VPAHPND阳性。针对以上结果,本研究选择SHIV、EHP和VPAHPND等三种病原,以及WSSV和IHHNV等两种传统常见的对虾病原作为检测目标。分别设计和优化针对SHIV、EHP、VPAHPND、WSSV、IHHNV的特异性巢式PCR引物,以所构建五种病原的阳性质粒为参照,建立并优化可同时检测五种病原的多重巢式PCR技术。结果显示,该多重巢式PCR方法对SHIV、EHP、VPAHPND、WSSV以及IHHNV的扩增产物片段大小分别为129 bp、176 bp、402 bp、230 bp和294 bp。其中,第一轮扩增的最佳退火温度为61℃,最佳引物浓度为0.32 μmol/L,EX Taq和dNTP最佳浓度分别为1.5 U/25 μL、1.5 mmol/L;第二轮扩增的最佳退火温度为60℃,最佳引物浓度为0.48 μmol/L,EX Taq和dNTP最佳浓度分别为1.5 U/25 μL、1.5 mmol/L。经检验,该多重巢式PCR检测技术对IHHNV的最低检测量为1 ×102copy/μL,VPAHPND、WSSV、EHP、SHIV 为 1×101copy/μL。其后,于广东省沿海养殖主产区选择未爆发病害的池塘采集凡纳滨对虾样品,采用该检测技术对其病原进行检测。结果显示,在所检测对虾样品中SHIV、EHP和WSSV的阳性率分别为8.02%、54.01%和15.51%。对汕尾养殖基地发病池塘对虾病原检测结果显示SHIV的阳性率为100%,EHP和WSSV分别为77.78%、44.44%。可见,该检测技术可有效运用于对虾养殖生产过程中的多病原高效监测。