第一部分基因多态性与先天性心脏病易感性的关联研究先天性心脏病是儿童非感染性疾病的首要死因,在活产儿中的发病率大约是1%,在自然流产的胎儿中约为5-10%。在中国高发地区报告先心发病率为0.73%,染色体异常和环境致畸因子所引起的先天性心脏病只占其发病原因的很小一部分,到现在为止,只有很少几个基因突变被发现与先天性心脏病发生有关,如NKX2.5,GATA4和BMP10。先天性心脏病发病原因还不是很清楚,大部分先天性心脏病是自然发生的,可能是由不同基因相互作用或者与其它因素共同作用以决定疾病的病因。与心脏发生有关的基因的多态性变化可能与心脏发育过程中基因的表达及生物活性有关,因此可能与先天性心脏病发生的易感性有关。心脏是发育过程中第一个形成和有功能的器官。心脏发育过程中,血管内皮生长因子(VEGF),NFATc1,Notch,Wnt/β-catenin,BMP/TGF-β,ErbB和NF1/Ras等起到重要作用。其中VEGF时间空间上的表达次序表明VEGF在心内膜垫形成有特殊作用,同时,动物实验表明转基因鼠引起VEGF水平增加2-3倍可以引起先天性心脏病的发生,同时研究也发现右室流出道VEGF水平增加可以引起心内膜和心肌结构发育异常,可能与先天性心脏病发生有关。本研究采用病例对照研究方法,对VEGF、NFATc1等基因的功能性SNPs单独或联合与先天性心脏病遗传易感性的关系进行研究,以研究先天性心脏病的发病机制和发现与我国人群先天性心脏病相关的危险基因型,并将其作为分子标志物用于筛选高危人群或易感个体从而为实施目标明确的个体预防等方面具有重要的理论和实践意义。1.血管内皮生长因子(VEGF)与先天性心脏病发病风险的病例对照研究采用以医院为基础的病例对照研究,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction FragmentLength Polymorphism,PCR-RFLP)的方法检测VEGF基因型;使用酶联免疫吸附试验enzyme linked immu-nosorbent assay(ELISA)方法,检测病例组和对照组血浆中VEGF水平,结果显示,先天性心脏病患者的血浆VEGF平均水平为252.85(±200.88)ng/L,显著高于对照组的平均水平211.32(±206.97)ng/L(P=0.024)。同时按照先天性心脏病并发症如紫绀型心脏病和先天性心脏病肺动脉高压进行分类,发现血浆VEGF平均水平在肺动脉高压患者中273.12(±233.57)ng/L和43例紫绀型心脏病患者314.70(±291.75)ng/L大于288例对照中211.32(±206.97)ng/L,P=0.020和P=0.030,而血浆平均VEGF水平在其它92例先天性心脏病和288例非先心对照中的差异并不明显(P=0.611),同时我们比较了病例和对照中不同基因型组血浆VEGF水平,在四个不同位点中血浆VEGF水平未发现明显差别。运用Logistic回归模型分析VEGF基因型与先天性心脏病发生危险因素的关系,总的和根据病种(VSD,TOF)分层分析均未发现VEGF基因型与先天性心脏病相关。2.活化T细胞的核因子(NFATc1)基因多态性与先天性心脏病膜周部室间隔缺损遗传易感性的病例对照研究活化T细胞的核因子(NFATc1)在瓣膜和间隔发育中起重要作用,NFATc1的多态性改变可能引起NFATc1表达的差异,因此有可能与间隔缺损或瓣膜缺损有关,本病例对照研究采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法检测NFATc1短重复序列S/L基因型,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PolymeraseChain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)的方法检测NFATc1 Cys751Gly基因型,共检测了膜周部室间隔缺损病例217名和非先心对照557名,运用Logistic回归模型分析NFATc1基因型与先天性心脏病膜周部室间隔缺损发生危险因素的关系。Logistic回归分析表明与NFATc1 SS基因型相比,LL基因型可显著增加膜周部室缺的风险(LL基因型的调整OR=1.68,95%CI=1.02-2.78)。对于NFATc1 Cys751Gly基因型与野生型纯合子基因型(Cys/Cys)相比,变异型杂合子(Cys/Gly)和变异型纯合子(Gly/Gly)均与先天性心脏病膜周部室间隔缺损的发病风险无统计学显著关联。研究结果表明,NFATc1基因短重复序列多态性LL基因型可增加先天性心脏病膜周部室间隔缺损发病风险,而NFATc1 Cys751Gly多态性改变未见与先天性心脏病膜周部室间隔缺损的发生存在显著关联。3.ET1Taq1多态性与先天性心脏病易感性关系的研究内皮素1(ET1)是由内皮和平滑肌细胞产生的强大的血管收缩肽,在不同的组织内均发现存在ET1,可能与血管收缩调节、细胞增殖等有关,而研究发现,ET1和其G蛋白耦联的受体在正常胚胎发育过程中起重要作用,与神经嵴细胞的发生有关,因此有可能与先天性心脏病的易感性有关。ET1是由EDN1基因编码的,其中ET1 Taq1多态性为内含子4的8000位点T/C的转换,可能引起ET1表达的差异,因此可能与先天性心脏病的易感性有关,本病例对照研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase ChainReaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)的方法,检测了ET1 Taq1基因型与先天性心脏病膜周部室间隔缺损发生危险因素的关系,共检测了膜周部室间隔缺损病例217名和非先心对照557名,Logistic回归分析表明与ET1 Taq1 TT基因型相比,携带ET1 Taq1 CC等位基因显著降低先天性心脏病膜周部室间隔缺损发病危险(CC基因型的调整OR=0.43,95%CI=0.20-0.94)。研究结果表明,ET1 Taq1基因多态性CC基因型可显著降低先天性心脏病膜周部室间隔缺损发病风险,ET1 Taq1基因多态性CC基因型可能是先天性心脏病膜周部室间隔缺损的发生的保护性因素。4.亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFR及相关基因多态性与先天性心脏病易感性关系的研究母亲高同型半胱氨酸血症可导致后代先天性心脏病发生的危险性增加,补充叶酸能降低血浆同型半胱氨酸水平,减少先天性心脏病的发病风险。MTHFR是叶酸代谢通路中一种重要的酶,研究发现MTHFR基因C677T多态与MTHFR酶的活性有明显关系,MTHFRC677T多态性改变可导致其编码的代谢酶热稳定性降低,从而影响叶酸-同型半胱氨酸代谢,与先天性心脏病的危险因素有关。研究发现,MTHFR C667T基因多态性与先天畸形有关,胎儿携带MTHFR667TT基因型增加胎儿2.9倍的神经管畸形发生率,同时胎儿MTHFR C677T基因多态性和先天性心脏病发病风险有关,胎儿携带TT基因型与肺动脉瓣狭窄,左心发育不良综合症,主动脉狭窄,主动脉瓣狭窄和主动脉瓣下狭窄的危险因素有关。同时,叶酸通路的其它多态性位点如MTHFR A1298C、MTHFR G1793A、MTHFD T401C、MTHFD G1958A可能与胎儿叶酸代谢有关,与先天性心脏病的危险因素有关。因此我们采用病例-对照研究设计,共有病例502例,非先心对照527例。采用PCR-RFLP的实验方法检测各位点基因型,Logistic回归计算子代MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTHFR G1793A、MTHFD T401C、MTHFD G1958A多态性变化和先天性心脏病发病危险,结果表明,子代MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTHFRG1793A、MTHFD T401C、MTHFD G1958A多态性变化可能与其先天性心脏病发病危险无明显相关。需要进一步研究母亲怀孕期间血浆同型半胱氨酸水平以及母亲MTHFR、MTHFD多态性和先天性心脏病的关系。第二部分基因多态性与肺癌易感性关系的病例对照研究肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内,在男性中每年有900,000例新发肺癌,在女性中每年新发肺癌的人数则为330,000例,2002年我国肺癌死亡人数为32.7万,2005年则增至49.7万。大部分肺癌在吸烟人群中发生,与长期暴露于吸烟环境有关。尽管吸烟是发生肺癌最重要的因素,但吸烟人群中,仅仅不到20%的吸烟者发展为肺癌,提示遗传因素在肺癌中的作用,个体对肺癌存在易感性。研究表明,细胞周期紊乱和细胞癌变有关,分子生物学研究发现肿瘤是由于包括肿瘤抑制基因以及主要的癌基因的多种基因缺陷引起的、在细胞癌变过程中,癌基因/抑癌基因的调控,以及细胞周期调控因子参与癌变的过程的调节,细胞周期调控的异常可导致细胞的持续性增殖,是肿瘤发生的生物学基础。细胞周期的调控涉及到细胞周期素(cyclins)、细胞周期素依赖激酶(cyclins-dependent kinases,CDKs)以及细胞周期素依赖激酶抑制蛋白(CDK inhibitors,CKIs)。其中CDKs处于调控的中心地位,而cyclins起正调节作用,CKIs发挥负调节作用。细胞周期调控的基因存在个体差异,其差异部分是与单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)有关,SNPs是人类最常见的遗传变异。因此我们提出研究假设:(1)细胞周期调控通路中功能基因多态性单独或联合与肺癌易感性有关;(2)相关的基因多态性与环境因素(如吸烟)存在交互作用,可能与肺癌的发生发展有关。因此我们在肺癌中对肺癌发生的环境因素以及细胞周期调控基因通路中具有明确功能的基因,采用分子流行病学病例-对照研究方法,并应用SNP高通量技术Illumina平台,对细胞周期调控基因通路中相关基因的多态性位点进行检测,并研究这些多态性单独或联合作用与肺癌易感性的关系,以及吸烟与多态性位点进行基因-环境交互作用以研究遗传因素和环境因素与肺癌发生的危险,从而阐明肺癌发生的分子遗传学机制以及细胞周期调控基因-环境交互作用具有重要的指导意义。同时,可以通过本研究发现我国人群肺癌发生的危险基因,可作为筛选高危人群及易感性个体的分子标志物,从而对肺癌的个体预防与早期诊断有重要意义。