第一部分基于数据挖掘探讨中药治疗外伤性视神经病变的用药规律目的:整理近20年以中药治疗外伤性视神经病变(Trauma optic neuropathy,TON)的临床研究类文献,运用数据挖掘技术对文献中涉及的中药处方进行系统分析,探究中药治疗TON的用药规律,为临床提供参考和指导。方法:通过计算机检索中国知识资源总库(China national knowledge infrastructure,CNKI)、万方数据库、维普数据库自2000年1月至2020年9月关于中药治疗TON的临床文献,按照纳入、排除标准筛选文献、提取数据,使用Excel 2016进行中药频次频率、四气五味、归经、功效特点分析,使用SPSS Modeler 18.0软件对频次≥7的高频中药进行关联规则分析,使用IBM SPSS25.0对频次≥5的高频中药进行聚类分析。结果:(1)本研究共纳入文献38篇,获得处方38个,共涉及74味中药,中药累及使用频次为392次,使用频次最多的前五位中药为:当归、川芎、赤芍、红花、柴胡。最常用的基础方为血府逐瘀汤和除风益损汤。(2)药物归经上,归于足厥阴肝经的中药频次最高,其次为手少阴心经、足太阴脾经;药性方面,温性药与寒性药使用频次最高;药味方面,使用频次在前三位的是苦味药、甘味药和辛味药。(3)中药功效类别上,使用频次位于前两位的是活血化瘀药和补虚药。(4)根据关联规则分析,置信度为100%时,支持度位于前三位的关联规则是川芎-桃仁、川芎-桃仁-红花、川芎-赤芍-红花。(5)根据聚类分析,可将中药聚为四类:藁本、前胡、防风聚为一类;熟地、白芍、当归聚为一类;红花、桃仁、牛膝、川芎聚为一类;柴胡、枳壳、桔梗聚为一类。结论:(1)中医治疗TON的高频次中药为当归、川芎、赤芍、红花、柴胡,功效类别以活血化瘀药和补虚药为主,支持度前三位的关联规则为川芎-桃仁、川芎-桃仁-红花、川芎-赤芍-红花,均体现中医治疗TON的治疗原则为活血化瘀、补虚行气;(2)治疗TON的中药多归于肝、心二经,且以苦味药和甘味药为主,寒温属性药物均有,符合活血化瘀药和补虚药的性味归经特点;(3)治疗TON最常用的处方为血府逐瘀汤和除风益损汤,聚类分析展现了治疗TON常用处方的组方配伍特点,即以活血化瘀药(红花、桃仁、川芎等)和补虚药(白芍、当归等)为主,辅以祛风解表药(藁本、前胡、防风)与行气药(柴胡、枳壳、桔梗)。第二部分基于网络药理学探究红花治疗外伤性视神经病变的机制目的:基于网络药理学及生物信息学的研究思路,探究红花治疗TON视神经损伤的潜在分子网络调控机制。方法:(1)通过中医药系统药理学数据库分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)筛选红花的活性成分及作用靶点,利用Uniprot数据库查询靶点蛋白对应的基因名称,并通过Cytoscape软件构建红花有效成分-基因靶点的调控网络;(2)在基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中筛选TON相关芯片,使用GEO2R筛选疾病差异基因,使用韦恩分析得到红花有效成分治疗TON的核心靶点;(3)使用Cytoscape 3.7.2软件构建红花对TON基因靶点的蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network,PPI),使用 BisoGenet、CytoNCA 软件包提取核心互作网络;(4)使用DAVID数据平台对筛选出的红花治疗TON的核心靶点进行基因本体论(geneontology,GO)功能注释和日本京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。结果:(1)本研究共获得红花17种活性成分,作用靶点共205个;筛选出GSE17117芯片中TON的差异表达基因共617个,其中上调基因429个,下调基因188个;(2)经过韦恩分析,筛选出红花治疗TON的核心靶点11个;(3)通过PPI网络构建和网络拓扑分析,共筛选出红花治疗TON的14个核心靶点蛋白;(4)GO富集分析结果显示,红花作用于TON的靶点主要富集于胞外间隙、细胞质基质、顶端细胞;所涉及的生物学过程包括凋亡过程的负调控、对有机物质的应答、凋亡过程中的正调控等;相关的分子功能主要为结合核激素受体、结合蛋白质复合物。(5)KEGG调控通路富集分析结果显示,红花调控TON的通路主要有肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)信号通路、癌症信号通路、雌激素信号通路、Toll样受体信号通路。结论:通过对红花有效成分治疗TON的网络药理学分析,我们推断出红花可能通过调节Caspase-3、基质金属蛋白酶-9(Matrix Metallopeptidas 9,MMP9)等靶点调控TNF等相关信号通路,干预视网膜神经节细胞(Retinal Ganglion Cells,RGCs)凋亡等生物学过程,从而在TON的治疗中起到视神经保护的作用。第三部分红花注射液对L-谷氨酸钠诱导的RGC-5细胞TNF凋亡信号通路的影响目的:在前两部分研究的基础上,运用体外实验验证红花注射液对视神经损伤后RGCs凋亡的调控机制。方法:(1)实验采用星孢菌素(Staurosporine,STSN)诱导RGC-5神经元性分化;采用CCK-8法,筛选RGC-5谷氨酸损伤模型中L-谷氨酸钠最佳损伤浓度和损伤时间,以及红花注射液干预RGC-5细胞的最佳浓度。(2)根据检测目标的需要,将RGC-5细胞按照1×105/ml的浓度接种至相应培养板中;经STSN诱导后的,分别标记为5个实验组:细胞对照组(A组)、L-谷氨酸钠模型组(B组)、红花注射液组(C组)、抑制剂Ac-DEVD-CHO组(D组)、红花注射液联合抑制剂组(E组)。A组添加DMEM-H培养基,B-E组加入所筛选的最佳L-谷氨酸钠损伤浓度培养基。根据筛选出的L-谷氨酸钠损伤时间孵育后,按照分组进行加样:A组加入DMEM-H培养基,B组加入同浓度的L-谷氨酸钠培养基,C组加入筛选出最佳浓度的红花注射液培养基,D组加入10μmol/L的Ac-DEVD-CHO培养基,E组加入最佳浓度的红花注射液联合Ac-DEVD-CHO培养基。培养24h后进行检测。(3)实验指标检测:采用免疫荧光法检测RGC-5细胞中Brn3a的表达;采用CCK-8法检测各实验组RGC-5细胞的存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Western-blot检测各组细胞I型TNF受体(tumor necrosis factor receptorI,TNFR1)、死亡结构域相关蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)、Caspase-8、Caspase-3 蛋白的表达水平。结果:(1)经筛选,浓度为0.5 μmol/L的STSN培养基孵育1 h可诱导RGC-5发生神经元形态改变。浓度为8mmol/L的L-谷氨酸钠干预18h所建立的RGC-5损伤模型,细胞凋亡率能够达到43.98%,最接近细胞半数凋亡剂量(half maximal inhibitory concentration,IC50)。60%的红花注射液干预 RGC-5 细胞 24h,细胞抑制率为41.34%,最接近IC50。最终选择0.5 μmol/LSTSN诱导RGC-5细胞1h促进RGC-5的分化,10 mmol/L的L-谷氨酸钠干预18 h建立RGC-5损伤模型,70%红花注射液作为本次实验的干预浓度。(2)免疫荧光结果显示,RGC-5细胞可以表达鼠类视网膜神经节细胞中的特异性转录因子Pou结构域转录因子3A(POU domain transcription factor 3A,Brn3A)。(3)细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测结果显示:与A组相比,B组细胞存活率仅为68.35%;C组细胞存活率为77.51%,D组81.13%,E组为86.88%;与B组光密度(optical density,OD)值相比,C、D、E组的OD值均显著增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。(4)流式细胞凋亡检测结果显示:各组RGC-5细胞凋亡率分别为:A 组 3.43%,B 组 25.75%,C 组 15.88%,D 组 14.21%,E 组 11.56%。与 B 组相比,C、D、E组的凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。(5)TNFR1/FADD/Caspase-8/Caspase-3凋亡信号通路相关蛋白表达水平:与B组比较,C、D、E组的TNFR1、FADD、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在TNFR1、FADD、Caspase-8蛋白表达水平上,C组与D组间无显著统计学差异(P>0.05),说明红花注射液与抑制剂Ac-DEVD-CHO 在调控 TNFR1、FADD、Caspase-8 蛋白上效力相当;在 Caspase-3蛋白表达水平上,C组与D组间有显著统计学差异(P<0.05),说明在降低Caspase-3蛋白水平上,特异性Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO较红花注射液效果更显著。此外,E组在降低Caspase-8、Caspase-3蛋白水平上,较C组、D组更显著(P<0.05),说明红花注射液联合抑制剂可以起到协同抑制细胞凋亡的作用。结论:(1)红花注射液能够有效抑制L-谷氨酸钠对RGC-5细胞的凋亡损伤,提高其存活率;(2)70%红花注射液能够发挥明显的抗凋亡作用,该作用可能通过抑制RGC-5细胞中TNFR1、FADD、Caspase 8、Caspase 3蛋白的表达水平,调控TNFR1信号通路实现的。