背景及目的主动脉夹层(Aortic Dissection,AD)是心脏外科极为危急的疾病之一，其起病急，病情进展快，预后极差，近年来发病率呈逐年增加趋势，目前已成为威胁人类健康的重要疾病之一。临床资料表明，主动脉夹层的发病率为5-30/100万，其中21%患者于院外死亡，68.2%患者在入院后48h内死亡，1w内病死率可达90%，死亡原因多为夹层破裂。就治疗手段而言，目前针对主动脉夹层的治疗手段仍十分有限，主要包括外科开放式手术和CT透视下血管腔内支架植入术，前者手术时间长难度大，创伤较大，患者预后较差；后者手术指针严格，且存在一定的复发率。因此，我们迫切需要从发病机制方面更深层次的对主动脉夹层的发生发展、疾病转归进行分析和研究，从而探寻新的预防和治疗手段来预防疾病发生，缓解病人痛苦，改善患者预后。主动脉中层主要是由胶原蛋白，弹力纤维及血管平滑肌细胞(Vascular smoothmuscular cell，VSMC)等构成，胶原纤维和弹力纤维之前的相互交联能够有效维持血管张力，而主动脉VSMC对血管壁营养的调节、创伤的应激及免疫反应的调节等方面均有着重要的作用。目前研究表明，主动脉血管壁中层的薄弱是主动脉夹层发生的重要原因之一。VSMC作为血管壁中层重要的细胞成分，同时又对血管壁结构和功能的维持有着重要的作用，现已成为学者对主动脉夹层发生原因的研究重点。细胞自噬(Autophagy)是细胞进行自我调节，自我保护的活动之一，其主要机制是在特定外界环境刺激，如能量缺乏、创伤和氧自由基等，激活细胞内多种蛋白和细胞通路，在胞内形成自噬小体，并逐渐成熟形成自噬体，对受损的蛋白、细胞器及外来组织进行吞噬和消化，并为细胞提供能量，维持细胞内环境稳定。细胞自噬可发生在所有的真核细胞中。在应激条件下，自噬可通过分解受损的细胞器来为细胞提供能量，亦可向细胞外排出受损的蛋白等来保护细胞。但当自噬活动过于强烈，则会出现自噬介导的细胞凋亡。因此，自噬对保持细胞和组织内的稳态，维持器官功能以及一些疾病的病理过程等有着重要的作用。近年来诸多研究表明，自噬参与了如肿瘤、神经系统疾病、缺血再灌注损伤等多种疾病的发生和发展。在心血管疾病方面，科学家们已在主动脉瘤、肺动脉高压、冠心病等患者的血管组织中检测到了自噬的发生。人血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是肾素血管紧张素系统(RAS系统)的重要效应蛋白，是由人血管紧张素I在血管紧张素转化酶的作用下形成，其主要通过AngⅡ1型受体(AT1)发挥作用，主要作用有诱导VSMC的过度肥大、细胞外基质的过度分泌；通过血液动力学，提高血压增强血流对血管壁的冲击；激活免疫系统，增加单核细胞的募集；增强巨噬细胞的活力，增强氧自由基的刺激等。目前研究表明，AngⅡ参与了诸多心血管疾病的发生发展过程。在课题组前期的研究过程中，我们已经证明了主动脉夹层患者血管壁中自噬表达量明显高于对照组。在本实验中，我们构建主动脉夹层小鼠，检测自噬在该小鼠血管壁的表达情况，并进一步使用AngⅡ处理VSMC，检测自噬在AngⅡ处理VSMC中的表达情况，对夹层小鼠血管壁中自噬表达情况和发生原因进行初步探讨。第一部分主动脉夹层小鼠模型的建立目的建立稳定且高效的主动脉夹层小鼠模型方法购入45只3w龄FVB小鼠，按照随机分配的方法，分为β-氨基丙腈(β-amino propionitrilemo nofumarate, BAPN)联合人血管紧张素-Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ, AngⅡ)组(联合干预组)，单BAPN组和对照组，每组15只小鼠。分别予以BAPN口服4w后联合AngⅡ皮下微泵48h，单BAPN口服4w和正常喂养进行干预。干预期间，定期监测小鼠体重变化和饮水量的变化，根据小鼠的体重变化和每天饮水量的变化动态调整药物剂量。干预结束后，取小鼠主动脉血管壁进行HE和VB染色，观察夹层形成情况。结果干预过程中，两个干预组均有小鼠死亡，其中联合干预组小鼠死亡率为33.3%，单BAPN干预组小鼠死亡率为20%；三组小鼠在干预期间体重变化无明显差异；在联合干预组中，小鼠夹层发生率为86.66%，单BAPN组中的发生率为46.6%，对照组无夹层发生；病理切片HE染色可见在夹层小鼠中，血液流入血管壁中，形成夹层，在干预组未形成夹层的小鼠和对照组未见明显假腔；VB染色可见在干预形成的夹层小鼠中，血管壁弹性纤维层数减少，出现断裂，有明显假腔形成；干预组未形成的小鼠中，可见弹性纤维层数减少，出现缺失和断裂，但未见假腔形成；对照组血管壁正常，弹性纤维丰富。结论BAPN联合AngⅡ干预能够成功且高效的诱导FVB小鼠发生急性主动脉夹层，且联合干预组夹层发生率高于单BAPN组。第二部分自噬标志基因在主动脉夹层血管壁中的表达目的探究主动脉夹层小鼠血管壁中自噬标志基因及蛋白的表达方法取第一部分实验中获得的血管壁，分别保存于液氮中和制成蜡块。在液氮下研磨血管壁，用Trizol法提取血管壁中的mRNA，采用RT-PCR法对联合干预组，单BAPN干预组及对照组小鼠血管壁中LC3B及Beclin1mRNA进行定量检测；采用免疫组织化学染色法对石蜡切片进行染色，对三组小鼠血管壁中LC3B及Beclin1蛋白进行定位和半定量检测。结果RT-PCR法检测结果表明，联合干预组及单BAPN组中发生夹层的小鼠，主动脉血管壁自噬标志基因水平显著高于对照组。在发生夹层的小鼠中，联合干预组和单BAPN干预组自噬基因水平基本一致。未发生夹层的小鼠自噬标志基因水平均要低于发生夹层的小鼠，高于对照组；其中联合干预组自噬标志基因水平高于单BAPN干预组。免疫组化染色提示在联合干预组及单BAPN组，发生夹层的小鼠均可见自噬相关蛋白呈阳性染色，主要定位于血管中层VSMC中；两个干预组中未发生夹层的小鼠均未见阳性染色。对照组未见阳性染色。结论在主动脉夹层血管壁中发生了自噬；自噬主要定位于血管壁中层；联合干预组和单BAPN干预组自噬水平存在差异。第三部分AngⅡ及BAPN对VSMC自噬的影响目的探究AngⅡ及BAPN对VSMC自噬的影响情况方法取大鼠原代VSMC解冻、复苏，待VSMC传至第3代，代谢及形态基本稳定时，分别配置不同浓度（10-4mol/L，10-5mol/L及10-6mol/L）的AngⅡ培养基及浓度为10-2mol/L BAPN培养基刺激大鼠VSMC，于干预后24h及48h检测自噬在VSMC中的表达情况。结果不同浓度的AngⅡ刺激VSMC24h，自噬标志基因未见明显升高；10-4mol/L及10-5mol/L浓度的AngⅡ在刺激VSMC48h后，自噬标志基因相对于对照组明显升高，10-6mol/L组未见自噬标志基因升高。10-2mol/L BAPN处理24h未见到自噬标志基因的升高，处理48h可见VSMC自噬标志基因升高，升高程度低于单AngⅡ干预组。结论AngⅡ及BAPN能够诱导VSMC发生自噬，且这种效果与处理的浓度和时间有相关性，其中AngⅡ诱导自噬程度高于BAPN。