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B7-H4(B7x,B7S1)是最近发现的B7家族新成员,属一类共抑制分子,具有抑制T细胞活化的功能。本实验构建B7-H4真核荧光表达载体并转染小鼠胰岛细胞系NIT-1,将B7-H4基因修饰的NIT细胞(命名为B7-H4-NIT)过继输入STZ(链脲佐菌素)诱导的C57BL/6小鼠I型糖尿病模型,观察对实验性I型糖尿病的影响,并探讨其作用机制。 目的: 本研究可望进一步阐明I型糖尿病的发病机制,并为临床应用胰岛细胞移植治疗I型糖尿病提供实验依据。 方法: 一、小鼠B7-H4及人IgG Fc基因克隆及真核表达质粒pmB7-H4-Ig及pmB7-H4-GFP的构建与鉴定 分别从小鼠脾脏和人外周血单个核细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术获取编码小鼠B7-H4胞外段(B7-H4ext)和人IgG Fc的cDNA,分别将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1,重组为pcDNA3.1-B7-H4ext-IgG Fc。经酶切鉴定及测序分析证实,所克隆和构建的小鼠B7-H4ext-IgG Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确,表明已成功构建可溶性B7-H4胞外段与人IgG Fc融合基因(B7-H4Ig)的重组真核表达质粒。 扩增小鼠B7-H4(mB7-H4)cDNA全长,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1,构建表达跨膜型mB7-H4-GFP融合蛋白的真核表达载体pmB7-H4-GFP。 二、转染细胞 按照LipofectamineTM2000说明书进行操作:将pmB7-H4-Ig及pmB7-H4-GFP分别转染COS7细胞和293T细胞;将表达载体pB7-H4-GFP及空载体分别转染NIT细胞,72小时后加G418筛选。 三、测定B7-H4-GFP融合基因修饰的NIT胰岛素分泌水平 采用胰岛素刺激释放实验检测转染pB7-H4-GFP及空载体前后NIT细胞胰岛素分泌水平,分析转染B7-H4-GFP融合基因对NIT分泌胰岛素的影响。 四、细胞增殖反应 细胞过继第1天和第8天上午8点分别取5×106个EGFP-NIT或B7-H4-NIT细胞注入受者小鼠腹腔,第14天收集脾细胞进行单向混合淋巴细胞反应。 方法为:取C57BL/6小鼠脾细胞,加入5μM CFSE,37℃培养10分钟,加入冷的1640完全培养基终止标记,作为反应细胞。EGFP-NIT或B7-H4-NIT为刺激细胞,作用前37℃下加入30μg/ml丝裂霉素培养2至3小时,以受者小鼠脾细胞为反应细胞,分别取1×106个反应细胞和刺激细胞加样至96孔培养板进行反应。37℃,5％CO2条件下与刺激细胞培养5天后上流式细胞仪检测。 五、STZ诱导糖尿病模型的建立 采用大剂量一次注射方法:C57BL/6小鼠(20只),雄性,随机分为模型组(15只)和对照组(5只),禁食、禁水24小时后一次性腹腔注射STZ(180mg/kg),然后恢复正常饮食。尾静脉采血,动态监测血糖水平,连续3天血糖超过11.3mmol/L即视为造模成功,随后在实验过程中隔天检测1次血糖。 六、NIT-1细胞移植 洗涤转染空载体和B7-H4基因的NIT-1细胞(1.5×106),去除培养液中血清和其他成分,悬于0.5m1的PBS中,植入糖尿病模型C57BL/6小鼠肾包膜。每组15只小鼠,移植后每隔1天监测1次血糖、体重、生存时间。受者小鼠血糖水平≤8.4mmol/L被视为恢复正常,血糖持续3天高于11.1mmol/L被视为NIT-1细胞已被排斥。所有样本均进行复管检测,同一份样本两次结果的变异率小于5%。 七、RT-PCR检测细胞因子mRNA表达水平 采用Trizol试剂提取受者C57BL/6小鼠脾脏总RNA,紫外分光光度计检测其浓度。每份样本取2.5μg RNA进行反应,并以GADPH作为对照。GADPH、IL-4,及IFN-γ的引物如下: GAPDH:5‘-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3‘5‘-GGCATGGACTGTGGTC ATGA-3‘ IL-4:5‘-ATGTACCAGGAGCCATATC-3‘5‘-CGAAAAGCCCGAAG-3‘ IFN-γ:5‘-CTCAAGTGGCATAGATGTGGA-3‘5‘-CAGGTGTGATTCAATG ACGCT-3‘ GADPH、IL-4及IFN-γ目的产物分别为237、270和182bp,2%琼脂糖电泳后紫外线下拍照,经扫描后用科达图象分析处理软件1D(2.0版)进行分析,结果以样品DNA与相应GAPDH相对比率表示。 八、ELISA检测移植鼠脾脏IL-4和IFN-γ水平 收集分别移植PBS、EGFP-NIT和B7-H4-NIT组受体脾细胞培养上清,ELISA检测IL-4和IFN-γ水平。 九、流式细胞术检测细胞内细胞因子和调节性T细胞 取l×106/ml脾细胞于24孔板中,加入佛波醇酯、离子霉素和莫能霉素,37℃孵育4~5h;用含10g/L牛血清白蛋白(BSA)的 PBS液洗涤2次,加入FITC-CD8和PE-Cy5-CD4,室温孵育30min,用含10g/L BSA的PBS液洗涤2次;用40g/L多聚甲醛4℃固定30分钟,洗涤后加入穿孔液,室温静置20分钟,PBS液洗涤2次。加入PE-IFN-γ,室温染色30h,缓冲液洗涤,流式细胞仪检测产生IFN-γ的脾细胞。 移植受者小鼠处死后分离脾脏,无菌钢网(100目)上研磨,制成细胞悬液。常规裂解红细胞,磷酸盐缓冲液(PBS液)洗涤2次。尼龙筛过滤细胞悬液,去除细胞团及未研碎的细胞块,以 RPMI1640培养液重悬,塑料培养瓶中培养2h,除去单核细胞,收集未贴壁细胞并调整细胞浓度为l×106/ml。一部分培养后加入PE标记的抗CD25单抗、APC标记的抗FOXP3单抗及FITC标记的抗CD4单抗,流式细胞仪检测调节性T细胞。 十、肾脏的组织化学检测 细胞移植后14天处死动物,切除肾组织样本,福尔马林固定,石蜡包埋并切削至4μm厚,二甲苯脱蜡后进行苏木素-伊红染色。 十一、其他观测指标 移植术后第14天每组随机处死3只受鼠,取移植肾脏进行病理学检查;无菌分离受鼠脾细胞检测其IFN-γ表达及调节性T细胞数量,其余动物观察移植细胞存活时间、血糖水平及体重变化。 十二、统计学处理 所有数据均用配对或不配对的标准T检验及变异系数检验,结果以均数±标准差(S)表示。P<0.05代表有显著统计学意义。 结果: 一、成功构建pmB7-H4-Ig及pmB7-H4-GFP载体 序列测定证实克隆的mB7-H4全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实mB7-H4分别正确插入pcDNA3.1-hFc和pEGFP-N1载体中,两种表达载体分别转染。 COS-7细胞和293T细胞后可分别表达可溶性mB7-H4-Fc和跨膜型mB7-H4-GFP。 二、转染细胞稳定表达绿色荧光蛋白及B7-H4 成功筛选出稳定表达绿色荧光蛋白及B7-H4的NIT细胞系。荧光显微镜检测发现,两组细胞均可在细胞膜上表达绿色荧光蛋白;流式细胞仪检测发现,绿色荧光蛋白的表达率分别为90%和92%。 三、基因修饰的NIT细胞(EGFP-NIT及B7-H4-NIT)均可分泌胰岛素 转染第1天及第3天,放免试剂盒检测EGFP-NIT细胞及B7-H4-NIT细胞培养上清中胰岛素浓度,发现两组细胞均可分泌胰岛素,分泌水平无显著性差异(p>0.05)。 四、B7-H4-NIT细胞具有免疫抑制功能 CFSE标记的体外增殖实验证实,B7-H4-NIT细胞作用组小鼠脾细胞增殖指数与EGFP-NIT细胞作用组相比明显降低,结果有统计学意义(p<0.05)。 五、B7-H4-NIT受者组脾细胞高表达IL-4、低表达IFN-γ RT-PCR及ELISA检测各组细胞的细胞因子表达,与EGFP-NIT组及PBS组相比,B7-H4-NIT受体组脾细胞表达IL-4显著增高,IFN-γ表达水平明显降低。 六、B7-H4-NIT细胞受者组分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞数量减少 与EGFP-NIT及PBS组相比,B7-H4-NIT细胞受体组的脾细胞中,表达IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞数量明显减少,尤以CD8+T细胞更为明显(p<0.05)。 七、B7-H4-NIT细胞受者组调节性T细胞数量增加 流式细胞仪检测发现,与对照组比较,B7-H4-NIT细胞受体组CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数量明显增多(p<0.05)。 八、B7-H4-NIT受者组单个核细胞浸润减少 苏木素-伊红染色结果表明,与对照组比较,B7-H4-NIT细胞受体组单个核细胞浸润明显减少,肾包膜处可见NIT细胞成团,而对照组则无。 九、移植B7-H4-NIT细胞对T1D小鼠模型的治疗作用 除PBS组外,移植EGFP-NIT及B7-H4-NIT的两组小鼠,3天后其血糖水平均降低。EGFP-NIT组血糖水平在移植后第3天轻微下降,7天后逐渐上升,且未能恢复至正常血糖水平;B7-H4-NIT组在移植后第3天血糖恢复至正常水平,第12天达到最低,正常血糖水平维持17天后开始上升,20天后又表现为高血糖。另外发现,NIT-EGFP组小鼠体重持续减轻,B7-H4-NIT组体重于7天后有所回升,且受者存活时间比对照组明显延长。 结论: 本研究表明,表达B7-H4的胰岛细胞植入同种小鼠体内后,能抑制同种反应性T细胞增殖,减轻受者对同种细胞移植物的排斥反应,从而显著延长糖尿病小鼠生存时间。