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背景:真菌毒素为真菌产生的次级代谢产物,具有致癌、致突变、致畸等多种毒性,分布在小麦、玉米、饲料及多种食品中,一旦大量进入生态环境,将对动物、人及整个生物环境产生严重危害,因此倍受全球广泛关注。目前真菌毒素的检测方法主要有理化方法和免疫检测方法,理化方法灵敏度较高,但操作复杂,仪器昂贵,免疫方法一次只能检测一种毒素。因此,高通量的蛋白芯片方法将成为食品中真菌毒素快速检测的发展方向。方法:本实验先通过抗原制备、抗原鉴定、免疫、细胞融合与筛选等步骤制备桔青霉素单克隆抗体,然后以桔青霉素(citrinin,CIT)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和伏马菌素B1(fumonisin,B1)为研究对象,采用间接竞争免疫原理,以荧光信号为检测信号,确定CIT、DON和FB1人工抗原的最佳固定浓度、固定方式,抗CIT、抗DON、抗FB1三种单抗和IgG-Cy5二抗的最佳工作浓度,建立单独检测一种毒素的蛋白质芯片检测方法。并在此基础上初步建立同时检测三种真菌毒素的蛋白质芯片方法。结果:(1)经过三种方法的鉴定,桔青霉素人工抗原偶联成功;(2)通过免疫小鼠制备杂交瘤细胞株,获得了一株抗桔青霉素单克隆抗体的细胞株;(3)建立了桔青霉素间接竞争ELISA,其IC50为96.2 ng/ml,检测限为10 ng/ml,线性范围为10-810 ng/ml;(4)对大麦、玉米、饲料样品进行添加回收实验,回收率分别为99-127.1%、75.4-124.5%、78-108%。(5)确定了CIT、DON和FB1人工抗原固定最佳工作浓度,分别为1:100、1:500、1:250;三种真菌毒素单克隆抗体的最佳工作浓度为1:500、1:400、1:4000;IgG-Cy5二抗的最佳工作浓度为1:1000,最佳人工抗原固定条件是25℃固定16 h,绘制了三种真菌毒素竞争抑制曲线,IC50分别为63.7 ng/mL、83.5 ng/mL、54.6 ng/mL,线性范围分别为:10-810 ng/mL、10-810 ng/mL、1.9-125 ng/mL。(6)绘制了三种真菌毒素同时检测的竞争抑制曲线,CIT灵敏度(IC50)为25.7 ng/mL,线性范围10-810 ng/mL,DON灵敏度(IC50)为58.5 ng/mL,线性范围10-810 ng/mL, FB1灵敏度(IC50)为24.9 ng/mL,线性范围1.9-125 ng/mL。结论:通过制备抗桔青霉素单克隆抗体建立间接竞争ELISA,经添加回收试验初步验证该ELISA检测方法可用于实际样品的检测;根据我国规定的限量标准,初步建立的同时检测三种真菌毒素的蛋白芯片检测方法满足我国限量需求。