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肺癌的发病率和死亡率高居人类恶性肿瘤榜首,且二者呈现逐年升高的趋势。肺癌的预后差,五年生存率低。肺癌按组织学分类可分为小细胞肺癌(Small cell lung carcinoma,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC),其中85%是非小细胞肺癌。非小细胞肺癌早期主要通过手术切除以达到治疗的目的,晚期及转移患者主要通过以铂类药物为基础的传统全身化疗手段,但其副作用严重,且治疗效果不佳,仅能提升病人5%的五年生存率。而我国近来频繁发生的雾霾,也必将加重我国未来肺癌的发病率和致死率,因此发展治疗NSCLC的新策略迫在眉睫。近年来,以EGFR为靶标的靶向治疗等疗法,在晚期和转移性肺癌产生了可喜的临床疗效。引发了人们对肺癌多方位作用靶点的深入研究。烟草是导致肺癌的重要因素,烟草中含有的尼古丁可作用于肺癌细胞上的烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR),激活下游的信号通路而促进肺癌的发生和发展。同时研究发现,乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)除了作为一种神经递质在神经细胞中传递信息外,也可被非神经细胞合成并以自分泌和旁分泌的方式释放至细胞外液,作用于乙酰胆碱受体,参与调节细胞增殖、分化等基本的生物学活动,此被称为非神经元胆碱能系统。研究人员观察到,包括肺癌在内的多种肿瘤细胞也可合成和分泌乙酰胆碱,同时表达nAChR(Nicotinic acetylcholine receptor,烟碱型乙酰胆碱受体)和mAChR(Muscarinic acetylcholine receptor,毒蕈碱型乙酰胆碱受体)。且外源性的乙酰胆碱受体激动剂与内源性的ACh作用于nAChR和mAChR均能促进NSCLC细胞的生长增殖,且在肿瘤细胞中检测到了ACh与mAChR的高表达,对此,我们推断非神经胆碱能系统是肿瘤细胞生长增殖的另一个重要的信号通路系统。进一步的研究显示,在乙酰胆碱能受体的众多亚型中,仅毒蕈碱胆碱受体3(muscarinic receptor 3,M3R)表达显著上调,且与肿瘤的预后不良高度相关,且在多种肿瘤细胞中证实了M3R是AChR参与肿瘤进程的主要受体亚型,因此M3R逐渐受到关注,成为肿瘤细胞靶标研究的热点。多个研究结果显示,在NSCLC细胞中M3R的存在高表达现象,我们实验室前期采用RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction,逆转录聚合酶链式反应)方法证实了在多种NSCLC细胞中,M3R mRNA存在高表达,且观察到H1299细胞中胆碱转移酶CHAT同样高表达,说明NSCLC可自分泌或旁分ACh,并作用于自身的M3R而产生作用。因此,M3R能否成为NSCLC的新的治疗靶标,有待于通过研究进一步验证。因此,本研究以NSCLC H1299为研究对象,通过拮抗和敲除M3受体,采用SRB(Sulforhodamine B,磺酰罗丹明B)、实时无标记细胞检测技术(Real time cellular analysis,RTCA)、流式细胞术(Flow cytoMetry,FCM)、划痕实验、抗体芯片及Western Blot等方法,说明了M3R在H1299细胞生长增殖和转移中的重要地位,并进一步解释了M3R参与H1299细胞生长增殖和转移的分子机制。实验结果如下:(1)本研究首先采用SRB法观察M3R拮抗剂R2-8018【富马酸(R,R)-戊乙奎醚】和达非那新在1.25-80μM浓度范围内对H1299细胞生长增殖的影响,实验结果显示,R2-8018和达非那新能够浓度依赖性地抑制H1299细胞的增殖。之后我们采用RTCA方法观察到了同样的结果,且获得了实时抑制曲线。(2)RTCA法观察到外源性给予乙酰胆碱和卡巴胆碱无法促进H1299细胞的增殖。(3)FCM法测定R2-8018对H1299细胞周期时相的影响,观察到R2-8018能够时间和浓度依赖性地诱导H1299发生G0/G1期阻滞。(4)划痕实验结果显示,拮抗M3R可使H1299细胞迁移能力显著下降,提示M3R不仅参与了H1299细胞的增殖,同时还参与了H1299细胞的迁移。(5)采用CRISPR/Cas9技术敲除H1299细胞M3R基因,T7错配酶检测,M3R基因敲除成功。(6)RTCA法显示与野生型H1299细胞相比,M3R敲除后H1299细胞的生长活力显著降低。(7)RTCA法显示外源性的激动剂乙酰胆碱和M3R拮抗剂R2-8018及达非那新对M3R敲除型H1299细胞的生长增殖无明显影响。(8)FCM法检测细胞周期发现与拮抗M3R的结果一致,敲除M3R基因能够诱导H1299细胞产生G0/G1期阻滞。(9)划痕实验结果显示,敲除M3R可使H1299细胞迁移能力显著下降,与拮抗M3R抑制H1299细胞迁移能力的结果相一致。(10)抗体芯片结果显示,与野生型H1299细胞相比,敲除M3R后发现了磷酸化的EGFR显著下降,且MAPK和PI3K/AKT信号通路中几个关键蛋白发生了显著的变化。提示我们拮抗和敲除M3R很有可能是通过降低EGFR磷酸化,抑制MAPK和PI3K/AKT激活,从而抑制H1299细胞生长增殖。(11)通过Western Blot进一步研究显示,通过R2-8018拮抗和敲除M3R能够有效抑制PKC和EGFR蛋白的表达以及MEK/ERK1/2和PI3K/AKT通路的活性,而对P38MAPK影响较小,因此我们认为拮抗和敲除M3R主要通过EGFR/MEK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT来发挥作用。(12)通过Western Blot观察调控细胞周期的相关蛋白表达变化,结果发现R2-8018拮抗以及敲除M3R对细胞多个细胞周期蛋白(Cyclin)和周期依赖性激酶(Cell cycle dependent kinases,CDK)的抑制作用显著,升高了细胞周期依赖性激酶抑制因子(Cell cycle dependent kinases inhibitor,CDKI)的表达,此结果很好地解释了R2-8018作用和敲除M3R诱导H1299细胞发生周期阻滞的现象。(13)采用Western Blot方法观察到R2-8018拮抗和敲除M3R后H1299细胞基质金属蛋白酶2(Matrix metal proteinases 2,MMP2)表达显著降低,说明拮抗和敲除M3R可通过降低MMP2的表达,抑制H1299细胞转移。结论:拮抗和敲除M3R能够显著抑制H1299细胞的生长增殖和迁移,引起H1299细胞发生G0/G1期阻滞。拮抗和敲除M3R能抑制EGFR的磷酸化,抑制MEK/ERK1/2及PI3K/AKT通路的激活,最终通过抑制细胞周期的进程而发挥肿瘤抑制作用,并通过降低MMP2的表达,抑制H1299细胞的迁移。本研究可为确认M3受体作为抗肿瘤靶标提供依据,进一步而言,因为EGFR是非常明确的肺癌靶标,本研究可为确认M3R拮抗剂和EGFR拮抗剂联合用药靶向治疗非小细胞肺癌提供依据。