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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种对人类危害极大的恶性肿瘤。2018年最新的全球肿瘤统计分析结果显示,肝癌的发病率占全球癌症发病总数的4.7%,致死率占8.2%。中国是全球肝癌高发国家,每年新发病例数占全球新发病例数的50%以上。肝癌早期通常无明显症状,中晚期肝癌的症状则较多,如消瘦、乏力、肝区疼痛、消化道症状等。很多患者就诊时已属中晚期,错过手术治疗的最佳时期。索拉非尼作为可口服的小分子激酶抑制剂,是首个获批用于治疗晚期肝细胞癌的分子靶向药物,其在临床治疗中发挥了显著的疗效。但索拉非尼治疗晚期肝癌的效果依然有限,且随着耐药性和一些不良反应的发生,影响了其疗效的发挥。为提高治疗效果、减少不良反应,近年来有关索拉非尼联合用药治疗肝癌的研究越来越多。青蒿琥酯为青蒿素的衍生物,现为临床安全有效的抗疟药,近年来研究发现其在体内外对肿瘤均有抑制作用,且能与其他化疗药物联用产生协同抗肿瘤作用。本课题研究青蒿琥酯和索拉非尼组合使用在体内外对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨其联合应用潜在的机制,为索拉非尼在临床上联合治疗提供新思路。研究目的:研究索拉非尼和青蒿琥酯组合使用对肝癌细胞增殖和凋亡的作用,并探讨其潜在机制。研究方法:采用MTT方法,分别评价索拉非尼、青蒿琥酯两者单用及联合使用对肝癌细胞增殖的影响;采用周-特氏联合指数法（Chou-Talalay combination index analysis）评价索拉非尼和青蒿琥酯联合使用对肝癌细胞增殖抑制的协同作用;采用Hoechst/PI染色及Caspase3/7试剂盒,评价索拉非尼、青蒿琥酯单用及联合使用对肝癌细胞凋亡的影响;应用二氯荧光素（Dichlorofluorescein,DCF）法检测青蒿琥酯对肝癌细胞活性氧产生的影响;应用Western blot方法检测索拉非尼、青蒿琥酯单用及联合使用对凋亡蛋白及细胞信号通路的影响;应用荷瘤裸鼠评价索拉非尼和青蒿琥酯联合使用对肝癌细胞体内增殖的影响。研究结果:青蒿琥酯单独使用可剂量依赖性地抑制肝癌细胞HepG2、PLC/PRF/5、HCCLM3、Hep3B和HuH7的增殖,IC50分别是37.4μmol/L、121.2μmol/L、44.2μmol/L、41.6μmol/L、46.4μmol/L。索拉非尼单独使用也能剂量依赖性地抑制肝细胞癌HepG2、PLC/PRF/5、HCCLM3、Hep3B和HuH7的增殖,IC50分别是6.1μmol/L、7.4μmol/L、14.7μmol/L、3.6μmol/L、2.6μmol/L。青蒿琥酯对肝癌细胞增殖的抑制活性较索拉非尼弱。Hoechst/PI染色结果显示,10μmol/L索拉非尼与不同浓度（10、30、100μmol/L）的青蒿琥酯联用与索拉非尼单药组相比,HuH7细胞凋亡率增加了18.4%、44.6%、69.5%;HepG2细胞凋亡率增加了2%、14%、48.1%;PLC/PRF/5细胞凋亡率增加了5.9%、22.9%、51.7%。在Caspase3/7激活实验中,索拉非尼和青蒿琥酯联合使用明显增加了HuH7、HepG2和PLC/PRF/5细胞Caspase3/7活化水平。Western blot实验结果表明,联合用药组HuH7细胞线粒体Bax/Bcl-2水平显著高于单独用药组。DCF法检测细胞内活性氧结果显示,青蒿琥酯可增加HuH7和Hep3B细胞内活性氧的水平。加入抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）可剂量依赖性地减弱青蒿琥酯对HuH7和Hep3B细胞增殖的抑制作用,提示我们青蒿琥酯通过产生活性氧发挥抗肿瘤作用。我们探讨了联合使用索拉非尼和青蒿琥酯产生协同抗肿瘤作用的机制。索拉非尼是蛋白激酶抑制剂,通过抑制Raf/MEK/ERK和JAK2/STAT3信号传导通路抑制肿瘤生长。Western blot实验结果表明索拉非尼单用可降低p-ERK和p-STAT3的水平,青蒿琥酯单用却增加了p-ERK和p-STAT3的表达水平,两者联合使用时索拉非尼能够有效逆转青蒿琥酯诱导的p-ERK和p-STAT3水平升高。我们推测,青蒿琥酯通过促进细胞产生活性氧发挥抗肿瘤作用,但其对p-ERK和p-STAT3的激活作用在一定程度上促进了细胞的存活,联合使用时,索拉非尼抵消了其对p-ERK和p-STAT3的激活作用,从而产生协同抗肿瘤作用。为了验证该假设,我们采用ERK信号通路特异性抑制剂PD0325901或STAT3通路特异性抑制剂Stattic,发现其与青蒿琥酯联合使用均具有明显的协同作用。为了进一步验证索拉非尼和青蒿琥酯联合使用的抗肿瘤活性,我们采用裸鼠移植瘤模型来观察其在体内对肿瘤的生长抑制情况。裸鼠体内实验结果显示,与正常对照组相比,青蒿琥酯组有抑制肿瘤生长的趋势,索拉非尼组能明显抑制肿瘤生长。但联合用药组与索拉非尼单用组相比无统计学差异。我们推测可能与青蒿琥酯自身抗肿瘤活性弱及半衰期短有关。本研究结果表明索拉非尼能够逆转青蒿琥酯对ERK和STAT3信号通路的激活作用,二者组合使用在体外具有协同抗肝癌的作用。课题组正在对青蒿琥酯的结构改造开展研究,旨在发现活性更强并具有良好药代动力学特点的新型青蒿素类抗肝癌药物,未来能够单独或与索拉非尼组合给肝癌的治疗带来潜在益处。研究结论:1.索拉非尼能够剂量依赖性地抑制肝癌细胞增殖。2.青蒿琥酯能够剂量依赖性地抑制肝癌细胞增殖,但活性较索拉非尼弱。3.索拉非尼和青蒿琥酯组合使用在体外能够协同抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。4.索拉非尼与青蒿琥酯协同抗肿瘤机制可能与索拉非尼抑制青蒿琥酯对ERK和STAT3信号通路的激活有关。5.青蒿琥酯体外抗肝癌活性弱,而且半衰期短,这些不利因素可能影响其体内抗肿瘤活性。6.对青蒿琥酯进行结构修饰,发现活性强并具有良好药代动力学特点的新型青蒿素类衍生物,单独或与索拉非尼组合使用将为肝癌的治疗带来潜在的益处。