代谢组学是研究内源及外源因素对细胞生理代谢影响的一种有效手段。目前代谢组学研究大多采用半定量的方式,只能得到代谢物浓度上调或下调的倍数,实现不了代谢物浓度的绝对定量,给细胞生理代谢调控机理的深入研究造成了困难。本文将综合LC-MS/MS分析方法和13C同位素标记技术的优点,建立一种准确可靠的胞内代谢物浓度的绝对定量方法,并将该方法应用到毕赤酵母表达β-半乳糖苷酶的代谢过程研究中。首先利用三种色谱柱实现了包括有机酸、磷酸糖、核苷类化合物和氨基酸等在内的64种化合物的超高效液相色谱分离,考察了不同的流动相pH和离子对试剂对保留时间的影响。在此基础上对质谱条件进行优化,得到了合适的检测离子对和碰撞电压,建立了完整的LC-MS/MS检测方法。将LC-MS/MS检测方法与13C同位素标记技术相结合,建立了同位素稀释质谱法(IDMS)的标准曲线,实现了53种化合物浓度的绝对定量,检测限可达到1 μmol/L。评价结果表明,该标准曲线具有高度的精确性,相关系数达到0.99以上,而且重现性好,受实验条件和仪器操作条件的影响很小。将建立的定量代谢组学方法应用于研究毕赤酵母表达p-半乳糖苷酶的低产菌GHL、高产菌G1HL和G1HL补加谷氨酸后的代谢差异。宏观代谢数据发现,G1HL生长速率和底物消耗速率都低于GHL,而补加谷氨酸后其生长速率和底物消耗速率都能恢复到低产菌水平,且产量有进一步提高。定量代谢组学和同位素非稳态13C代谢通量分析相结合的研究说明了这些差异产生的原因。在以葡萄糖为唯一碳源的培养条件下,p-半乳糖苷酶的高表达使高产菌对能量、还原力和氨基酸的前体的需求大大增加,造成胞内代谢物浓度降低。在加入谷氨酸后,TCA循环下游通量基本不变,上游通量减小50%,糖酵解途径下游通量明显增加,使G1HL对能量和还原力的需求压力得到缓解,代谢物水平回复到与GHL相近的水平,有利于更多β-半乳糖苷酶的生成。宏观和微观两方面的研究加深了我们对毕赤酵母代谢特性的认识,为进一步的菌株改造或工艺优化提供了理论依据。