目的:　　使用基于血液生物标志物检测的小鼠过敏试验方法和大鼠全身类过敏试验方法评价中药注射剂GG）和LG的过敏性，筛查具有代表性的过敏和类过敏敏感指标，为下一步开展对该产品制备工艺的优化及质控标准的提升提供基于安全性的检测方法和评价标准。　　方法:　　(1)小鼠过敏试验:　　采用基于血液生物标志物检测的小鼠过敏试验方法，对中药注射剂GG两个批号产品(GG1、GG2)和中药注射剂LG两个批号产品(LG1，LG2)分别进行小鼠过敏试验。　　将ICR小鼠288只随机分为12组:NS组、GG1组、GG2组、LG1组、LG2组、OVA组、NS+alum组、GG1+ alum组、GG2+alum组、LG1+alum组、LG2+alum组、OVA+alum组，每组24只。NS组动物皮下注射NS致敏液，GG1组、GG2组、LG1组、LG2组动物分别皮下注射GG1、GG2、LG1、LG2致敏液， OVA组动物皮下注射OVA致敏液;NS+ alum组动物皮下注射NS+alum致敏液，GG1+alum、GG2+alum、LG1+ alum组、LG2+alum组动物分别皮下注射GG1+alum、GG2+alum、LG1+ alum、LG2+alum致敏液，OVA+alum组动物皮下注射OVA+alum致敏液。各组动物隔日致敏一次，共3次。于末次致敏后的第11天，按单双数分成2批动物，先后进行下列实验。　　①末次致敏后第11天小鼠12只（单数部分），分别尾静脉注射相应激发液0.5ml/只进行激发，观察激发后30min内小鼠过敏反应症状，按小鼠全身致敏性评价标准对受试动物的过敏性以及过敏反应等级进行评判。激发后30min，腹主动脉取血制备血浆和血清，检测血浆组胺水平，血清β-氨基己糖苷酶、类胰酶、IgE含量。　　②末次致敏后第11天小鼠12只（双数部分），腹主动脉取血制备血清，ELISA定量检测抗体IgE，荧光蛋白芯片检测抗体IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgD。另取SD大鼠随机分为12组:NS组、GG1组、GG2组、、LG1组、LG2组、OVA组、NS+alum组、GG1+alum组、GG2+alum组、LG1+alum组、LG2+alum组、OVA+alum组），每组6只。于脊柱两侧分别皮内注射各抗血清原液、1∶4、1∶16、1∶64稀释液共4点，50μl/点。给药位置轮转。48h后尾静脉注射含0.5％伊文思蓝的相应剂量的抗原进行攻击，0.5ml/只。30min后剪取背部皮肤，测量蓝斑直径。蓝斑直径大于0.5cm为过敏反应阳性。随后将皮肤蓝斑剪碎于3mL丙酮-生理盐水(7∶3)混合液中过夜，次日于610nm波长处测定伊文思蓝渗出量(OD值)。　　(2)大鼠全身类过敏试验:　　将SD大鼠240只随机分为30组，每组8只。其中，GG试验部分15组，设受试物GG1、GG2、GG3各4个剂量(1.3mg/kg、4mg/kg、12mg/kg、36mg/kg)共12组，另设阴性对照(NS)2组，阳性对照(C48/80)1组。LG试验部分15组，设受试物LG1、LG2、LG3各4个剂量(0.32mg/kg、0.96mg/kg、2.88mg/kg、8.64mg/kg)共12组，另设阴性对照(NS)2组，阳性对照(C48/80)1组。尾静脉注射给药，给药容量5ml/kg，给药后观察和记录30min内大鼠症状。按照大鼠类过敏反应症状强度评定标准对其类过敏反应等级进行评定。30min后，腹主动脉取血制备血浆和血清，检测其血液抗体(IgE、IgG)、活性物质(组胺、类胰酶、β-氨基己糖苷酶、LTB-4、5-HT)、细胞因子(IL-1、IL6、IL-10、TNF-α、CINC-1、GM-CFS)水平，观察其变化特征。　　(3)大鼠皮肤类过敏试验:　　SD大鼠36只，按体重随机分成6组，每组6只。分别对应于GG三个不同批号样品(GG1、GG2、GG3)和LG三个不同批号样品(LG1、LG2、LG3)的检测。GG每一个样品设400μg/ml、66.7μg/ml、11.1μg/ml、1.85μg/ml4个浓度，另设阴性对照（生理盐水）和阳性药对照(C48/80，15μg/ml)各1组。LG每一个样品设96μg/ml、16μg/ml、2.67μg/ml、0.44μg/ml4个浓度，另设阴性对照（生理盐水）和阳性药对照（C48/80，15μg/ml）各1组。在大鼠脊柱两侧皮内注射4个不同浓度的受试物、NS、C48/80共6个药物注射点，50μl/点。给药后立即尾静脉注射0.5％伊文思蓝染液1ml/只，15 min后剪取背部皮肤测量蓝斑直径，提取皮肤蓝斑染液，测定伊文思蓝渗出量（OD值）。类过敏评定标准:蓝斑直径大于0.5cm、且蓝染OD值与阴性对照比P＜0.05为阳性。　　(4)体外RBL-2H3细胞试验:　　取对数期RBL-2H3细胞，重悬后接种于96孔板培养24h后，加入台式缓冲液配制的受试物GG1、GG2、GG3各7个浓度药液(22732.8、5683.2、1420.8、355.2、88.8、22.2、5.55μg/ml)，LG1、LG2、LG3各7个浓度药液(5427.2、1356.8、339.2、84.8、21.2、5.3、1.33μg/ml)，作用30min后取上清测β-氨基己糖苷酶A上清值，计算β-氨基己糖苷酶释放率及其倍率。　　(5)敏感方法和敏感指标的验证:　　将SD大鼠80只随机分为20组，每组8只。其中，GG（临床不良反应阳性）试验部分10组，设受试物GG4、GG5各4个剂量(1.3mg/kg、4mg/kg、12mg/kg、36mg/kg)共8组，另设阴性对照(NS)、阳性对照(C48/80)各1组;LG（临床不良反应阳性）试验部分10组，设受试物LG4、LG5各4个剂量(0.32mg/kg、0.96mg/kg、2.88mg/kg、8.64mg/kg)共8组，另设阴性对照(NS)、阳性对照(C48/80)各1组。尾静脉注射给药，给药容量为5ml/kg，给药后观察和记录30min内大鼠症状。按照大鼠类过敏反应症状评价标准计算κ值，按照大鼠类过敏反应强度评定标准对其类过敏反应等级进行评定。30min后，腹主动脉取血制备血浆和血清，检测其抗体(IgE、IgG)、活性物质（组胺、类胰酶、β-氨基己糖苷酶）水平，观察其变化特征。同时进行大鼠皮肤类过敏试验，方法、分组和剂量设置同前。　　另对不同厂家中药注射剂LG两个同品种不同制剂形态产品LF（临床不良反应阴性）和同品种同规格产品LS（临床不良反应阴性）分别进行大鼠全身类过敏试验和大鼠皮肤类过敏试验，方法、分组和剂量设置同前。　　结果:　　(1)小鼠过敏试验:　　1)致敏后动物抗体血清:中药注射剂GG1、GG2和中药注射剂LG1，LG2抗血清中免疫球蛋白(IgE、IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgD)水平均无明显变化;　　2)致敏动物激发后血清:中药注射剂GG1、GG2和中药注射剂LG1，LG2血液活性物质（组胺、β-氨基己糖苷酶、类胰酶）和免疫球蛋白(IgE、IgG)水平均无明显变化;　　3)致敏动物激发后过敏反应症状:中药注射剂GG1、GG2和中药注射剂LG1，LG2小鼠过敏反应症状均为阴性;　　4)异种皮肤过敏试验:中药注射剂GG1、GG2和中药注射剂LG1，LG2大鼠皮肤蓝斑直径和蓝染OD值均呈阴性。　　(2)大鼠全身类过敏试验:　　1)整体症状评定:中药注射剂GG1、GG2、GG3静脉注射给予1.3mg/kg剂量受试物，三组部分动物出现耳红、瘙鼻、口鼻肿胀等轻微症状;给予4mg/kg、12mg/kg，三组动物除上述症状外，还出现呼吸急促，紫绀;给予36mg/kg，三组部分动物甚而出现呼吸困难、哮鸣音、步态不稳。中药注射剂LG1，LG2、LG3静脉注射给予0.32mg/kg剂量受试物，三组部分动物出现耳红、瘙鼻、口鼻肿胀等轻微症状;给予0.96mg/kg，三组动物均出现耳红，部分动物还出现活动减少，口鼻肿胀，呼吸急促;给予2.88mg/kg，除上述症状外，部分动物还可见有紫绀和呼吸困难等症状;8.64mg/kg，全部动物均出现呼吸困难，部分还出现哮鸣音和步态不稳等症状。　　2)血液活性物质水平变化:中药注射剂GG1、GG2、GG3各剂量组组胺、β-氨基己糖苷酶和类胰酶水平随着浓度的升高而升高(P＜0.05或P＜0.01);GG1和GG3受试物12mg/kg剂量组血液IgG水平下降(P＜0.05)。进一步研究发现，给大鼠静脉注射GG1、GG2受试物，4mg/kg、12mg/kg、36mg/kg剂量组的5-HT水平下降、GM-CFS水平升高、36mg/kg剂量组的CINC-1水平升高(P＜0.01)，而各剂量组的血液LTB-4、IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α水平未见有明显的趋势性变化(P＞0.05)。中药注射剂LG1，LG2、LG3各剂量组组胺、β-氨基己糖苷酶和类胰酶水平随着浓度的升高而升高(P＜0.05或P＜0.01)。同时发现，静脉注射，LG1受试物8.64mg/kg组、LG2受试物0.96、2.88mg/kg、8.64mg/kg组动物血液IgG水平显著下降(P＜0.05)。进一步研究发现，给大鼠静脉注射LG1、LG2受试物，各剂量组血液LTB-4和GM-CFS水平明显上升，LG1受试物0.32mg/kg、8.64 mg/kg剂量组、LG2受试物0.32mg/kg、2.88 mg/kg剂量组血液TNF-a水平则显著下降(P＜0.01)。其余LG1、LG2受试物各剂量组的血液5-HT、CINC-1、IL-1、IL-6、IL-10、TNF-a水平与相应的阴性对照组比均无明显变化(P＞0.05)。　　(3)大鼠皮肤类过敏试验:　　中药注射剂GG1、GG2、GG3皮肤蓝斑直径和蓝染OD值随给药浓度的提高而逐步增大，按照类过敏评定标准，GG1在浓度为66.7、400μg/ml时被评定为类过敏阳性，相当于该产品说明书推荐的最大临床给药浓度的1/6、1倍;GG2在浓度为11.1、66.7、400μg/ml时被评定为类过敏阳性，相当于该产品说明书推荐的最大临床给药浓度的1/36、1/6、1倍;GG3检测结果同GG1。　　中药注射剂LG1，LG2、LG3皮肤蓝斑直径和蓝染OD值随给药浓度的提高而逐步增大，按照类过敏评定标准，LG1在浓度为16、96ug/ml时被评定为类过敏阳性，相当于该产品说明书推荐的最大临床给药浓度的1/6、1倍。LG2在浓度为2.67、16、96ug/ml时被评定为类过敏阳性，相当于该产品说明书推荐的最大临床给药浓度的1/36、1/6、1倍;LG3检测结果同LG1。　　(4)体外RBL-2H3细胞试验:　　受试物除GG1的22732.8μg/ml剂量组和LG1的5427.2μg/ml剂量组外，GG1和LG1其它6个剂量以及GG2、GG3各7个剂量组β-氨基己糖苷酶释放率及其倍率与空白对照组比均无显著差异(P＞0.05)。　　(5)敏感方法和敏感指标的验证:　　1)整体症状评定:静脉注射GG4、GG5受试物，1.3、4mg/kg剂量组动物口鼻肿胀和/或呼吸急促;12、36mg/kg剂量组动物呼吸困难，部分还出现哮鸣音和步态不稳等症状。静脉注射LG4、LG5，给予0.32mg/kg受试物，LG4组有2只动物出现搔鼻;给予0.96mg/kg，LG4、LG5组动物均出现口鼻肿胀和/或呼吸急促;给予2.88mg/kg，二组动物还可见有紫绀和呼吸困难等症状;给于8.64mg/kg，全部动物均出现呼吸困难，部分还出现哮鸣音和步态不稳等症状。静脉注射LF、LS受试物，各剂量组类过敏症状均为阴性。2）血液活性物质水平变化:静脉注射GG4、GG5受试物，4、12、36mg/kg剂量组大鼠血液组胺水平升高(P＜0.01)，但血液β-氨基己糖苷酶、类胰酶水平升高均不显著，IgE、IgG水平亦未见有明显的变化(P＞0.05)。静脉注射受试物2.88mg/kg，LG4组大鼠血液组胺水平、LG5组大鼠血液组胺、β-氨基己糖苷酶和类胰酶水平显著升高，IgG水平显著下降(P＜0.05或P＜0.01);静脉注射8.64mg/kg，二组血液组胺、β-氨基己糖苷酶、类胰酶水平均显著升高，IgG水平显著下降(P＜0.05或P＜0.01)。静脉注射受试物，LG4、LG5各剂量组大鼠血液IgE水平未见有明显的变化(P＞0.05)。静脉注射LF、LS受试物，各剂量组大鼠血液组胺水平、β-氨基己糖苷酶水平、血液类胰酶水平未见有明显变化(P＞0.05)　　结论:　　(1)小鼠过敏试验:中药注射剂GG1、GG2、GG3和中药注射剂LG1，LG2、LG3小鼠过敏试验结果为阴性。　　(2)大鼠全身类过敏试验:中药注射剂GG（GG1、GG2、GG3、GG4、GG5）和中药注射剂LG(LG1，LG2、LG3、LG4、LG5)大鼠全身类过敏试验结果均为阳性，中药注射剂GG1阳性起始剂量为1.3-4mg/kg，中药注射剂LG阳性起始剂量为0.96-2.88mg/kg。中药注射剂GG和LG类过敏反应血液阳性指标主要有:类过敏症状，血液组胺，β-氨基己糖苷酶，类胰酶，IgE，IgG，GM-CFS，CINC-1，5-HT。其中，血液指标最为敏感者为组胺、β-氨基己糖苷酶。　　(3)大鼠皮肤类过敏试验:中药注射剂GG(GG1、GG2、GG3、GG4、GG5)大鼠皮肤类过敏试验结果为阳性，阳性最低浓度为11.1～66.7μg/ml，相当该制剂产品说明书推荐的临床最高浓度的1/36～1/6倍。中药注射剂LG(LG1、LG2、LG3、LG4、LG5)大鼠皮肤类过敏试验结果为阳性，阳性最低浓度为2.67～16 ug/ml，相当该制剂产品说明书推荐的临床最高浓度的1/36～1/6倍。　　(4)体外RBL-2H3细胞试验:中药注射剂GG1、GG2、GG3和中药注射剂LG1，LG2、LG3体外RBL-2H3细胞试验均为阴性。　　(5)敏感方法和敏感指标的验证:中药注射剂GG(GG4、GG5)（临床不良反应阳性）大鼠全身类过敏反应均为阳性，阳性起始剂量为1.3mg/kg，相当该产品说明书推荐的临床使用剂量的0.8倍。中药注射剂LG(LG4、LG5)（临床不良反应阳性）类过敏反应均为阳性，阳性起始剂量为2.88mg/kg，相当该产品说明书推荐的临床使用剂量的7.2倍。GG4、GG5、LG4、LG5类过敏反应阳性指标主要有:类过敏症状，血液组胺和β-氨基己糖苷酶。不同厂家同品种同规格或同品种不同制剂形态产品中药注射剂LF、LS（临床不良反应阴性）大鼠全身类过敏反应和大鼠皮肤类过敏反应均为阴性。