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本研究主要通过探讨水牛小腔卵泡分离的方法,并比较不同成熟培养液对水牛小腔卵泡卵母细胞体外培养效果的影响,以期建立有效的水牛小腔卵泡分离和小腔卵泡卵母细胞的体外培养体系。
一、比较了不同的分离方法和酶作用的不同时间,以及不同的卵巢表面卵泡大小等因素对水牛小腔卵泡分离效果的影响。结果发现:采用机械与酶结合的方法分离水牛小腔卵泡时,平均每个卵巢获得5.64个小腔卵泡,显著高于机械法分离平均每个卵巢获得的3.12个小腔卵泡数(P＜0.05);当胶原蛋白酶作用12min或15min时,平均每个卵巢获得的小腔卵泡数均显著高于5min和10min处理组(P＜0.05),而12min与15min两组之间没有显著差异(P＞0.05),但当消化时间延长到20min时,卵泡膜被酶消化而破裂,没法分离到小腔卵泡;从表面具有小于2mm卵泡且无黄体的卵巢分离获得的小腔卵泡平均数显著高于表面无可见卵泡且有黄体的卵巢组的平均数(7.50vs2.25,P＜0.05)。
二、研究了在成熟培养液中添加不同浓度的FSI-I、LH、Activin对水牛小腔卵母细胞体外成熟的影响。结果显示:(1)当LH浓度为0.5μg/mL时,FSH添加浓度为2μg/mL的小腔卵泡卵母细胞体外成熟率(26.61±2.33％)和孤雌激活的囊胚发育率(2.75±1.00％)均显著高于其他各组(0,0.3,0.5和3μg/mL)(P＜0.5);(2)当FSH的浓度一定时(2μg/mL),随着LH浓度的升高,水牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟率及激活后囊胚发育率也相应提高,LH浓度为1μg/mL和2μg/mL时,小腔卵泡卵母细胞体外培养的成熟率(33.98±1.33％和32.97±4.33％)及孤雌激活后的囊胚率(5.83±1.33％和4.40±0.33％)显著高于对照组(17.35±0.33％和0％)和0.5μh/mL组(26.32±2.33％和2.11±0.33％)(P＜0.05),但两组间无显著差异(P＞0.05);(3)在培养液中,添加不同浓度的Activin对卵母细胞的体外成熟率无显著影响(P＞0.05),但添加浓度为100ng/mL(13.27±0.33％)和150ng/mL(9.64±2.33％)处理组卵母细胞激活后的囊胚率显著高于0ng/mL(5.81±1.33％)和50ng/mL(6.52±2.33％)组(P＜0.05),而前两组间差异不显著(P＞0.05)。
上述结果表明,采用酶与机械结合的方法,胶原蛋白酶浓度为3mg/L,消化12～15min最合适,且表面小于2mm可见卵泡无黄体状态的卵巢能收集到较多的小腔卵泡;在体外成熟培养液中,添加适量的FSH(2μg/mL)与LH(1μg/mL)以及Activin(100ng/mL)能有效的提高水牛小腔卵泡卵母细胞的体外成熟率以及卵母细胞孤雌激活后胚胎的发育率。