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[目的]
通过FVB HLA-Cw*0602转基因小鼠的繁育及纯合子小鼠的筛选,并用β型溶血性链球菌经不同途径感染HLA-Cw*0602转基因小鼠,研究微生物因素对转基因小鼠的银屑病诱导效应,以期获得具有人类银屑病样病理变化特征并能稳定遗传的转基因小鼠模型,为银屑病发病机理的探索提供研究基础,为银屑病治疗药物的开发研究提供有效的试验动物模型。
[方法]
选用前阶段试验获得的FVB HLA-Cw*0602转基因原代小鼠F01、F03和F06号与同品系FVB非转基因小鼠进行交配传代,自F2代起采用全同胞交配繁育至F3代。小鼠出生后12天从鼠趾中提取基因组DNA,用PCR法筛选阳性转基因小鼠,并根据F3代中每窝转基因小鼠的出现率筛选出假定纯合子小鼠。将假定的纯合子小鼠与同品系非转基因小鼠,最后根据其子代的基因整合率筛选出纯合子小鼠。
通过PCR方法扩增阳性转基因小鼠鼠趾基因组中的HLA-Cw*0602基因片段,PCR产物纯化回收后与pMD19-T Vector载体连接,将连接产物转化测序,鉴定其基因序列。
分别对6周龄FVB HLA-Cw*0602小鼠经腹腔注射丝裂霉素0.2mg/只,降低其免疫力,然后分别以皮肤创面感染、腹腔注射和皮内注射的方式给予β型溶血性链球菌,进行试验观察和微生物学检查。
[结果]
转入基因HLA-Cw*0602能在FVB小鼠体内遗传,且四代以内转基因小鼠表型基本无异常,也未见近交衰退现象。从F06号系的F2代中筛选出1只雄性拟定纯合子小鼠,经与相同品系的非转基因雌鼠交配后所产两窝共20只小鼠,PCR检测均呈阳性,证实为一纯合子小鼠。
经载体回收和转化后测序鉴定表明,PCR产物基因序列和HLA-Cw*0602片段基因序列相似性为98%。
6组FVB HLA-Cw*0602转基因小鼠经两种浓度三种途径感染β型溶血性链球菌均能引起小鼠死亡,从病死鼠的心脏穿刺液中均分离到β型溶血性链球菌。全部FVB HLA-Cw*0602转基因小鼠均未出现自发性银屑病样皮肤病。
[结论]
转入基因HLA-Cw*0602能在FVB小鼠体内遗传并存在突变现象,转入基因的遗传特征符合常染色体单位点整合。三个世代内便可筛选出纯合子小鼠,为后续研究奠定了基础。
FVB HLA-Cw*0602转基因小鼠经三种途径感染两种浓度的β型溶血性链球菌后未能自发性出现银屑病样皮肤病,说明在一定浓度下的β型溶血性链球菌感染与HLA-Cw*0602基因阳性双因素联合不能使FVB HLA-Cw*0602转基因小鼠自发性产生银屑病样皮肤病。