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跨膜转录因子Nrf1是CNC-bZIP家族中的重要成员,参与抗氧化、炎症反应等过程,在胚胎发育等方面中起重要作用。Nrf1锚定于内质网并发生糖基化修饰,当需要时通过p97提供“动力”使其TAD部分由内质腔一侧“翻转”至细胞浆质另一侧,再经去糖基化、泛素化、磷酸化等修饰,在未知蛋白酶的作用下进行剪切加工从内质网膜上释放,随后转移至细胞核调控下游靶基因。但是,Nrf1从内质网上释放入细胞核的分子机制仍未阐明,尤其是目前存在三种争议的加工模型。因此,本文以三个模型间“争议”的核心问题如位点特异性加工、蛋白酶体的作用、泛素化修饰的作用、Nrf1的分子特性等为基础,运用分子生物学手段从外源性、内源性两个方面进行阐明,以辨别三种模型之间的本质区别。具体研究主要体现在以下几个方面:1.明确Nrf1的N端加工是否具有位点特异性基于前期实验基础对Nrf1的NTD、AD1结构域进行分子内缺失突变,探寻影响N端加工的区域,免疫印迹结果发现85 kDa亚型受NTD内NHB2的影响。为进一步明确在NHB2的加工位置,通过删除/定点突变发现103WL104为加工的最佳位置,但并不具有位点特异性,受该位点在膜上的拓扑结构影响。类似的,在NTD、N298、Nrf1的N端与C端分别融合V5/VSVG/StrepII（净电荷为0）、eGFP标签,调整SDS-PAGE胶浓度,用不同的抗体检测到加工产生N端12.5 kDa小肽。进一步在V5-NTD-eGFP、V5-N298-eGFP中删除/定点突变NTD、AD1结构域,免疫印迹结果发现12.5 kDa小肽的产生同样不具位点特异性,与NHB2的跨膜结构密切相关。2.探究影响V5-NTD-eGFP、V5-N298-eGFP加工的因素构建缺失TM1区域的V5-N298-eGFP突变体,并转染至COS-1细胞,免疫印迹结果发现12.5 kDa的产生依赖于内质网;用特异性抑制剂NMS-873抑制p97后,V5-N298-eGFP、V5-NTD-eGFP两者中小肽的产生对其分别具有依赖性、非依赖性调控;siRNA干扰和过表达DDI-1、DDI-2实验表明DDI-1、DDI-2可对Nrf1 N端加工产生12.5 kDa小肽;意外发现氧化状态时可使Nrf1形成大分子量亚型;而且,在N298的N端与C端引入Gal4/UAS系统再次验证Nrf1在内质网上受其跨膜结构动态调控。3.鉴定内源性Nrf1的分子特性用蛋白酶体抑制剂活化HepG2、HL7702细胞中内源性Nrf1,并以Nrf1特异性敲除的细胞株(HepG2Nrf1α-/-、HL7702Nrf1α-/-、MEFNrf1-/-)作为对照,用Endo H去糖基化后,经SDS-PAGE、NuPAGE胶分离,结果发现,无论在哪种胶中Nrf1均存在四个主要的亚型。其中,在NuPAGE胶中主要亚型的分子量大小依次为120kDa（糖基化亚型）、105 kDa（部分去糖基化亚型）、95 kDa（全长的未糖基化或去糖基化亚型）、85 kDa（N端剪切产生的亚型）,而在SDS-PAGE胶中分别为A（140/145 kDa,糖基化亚型）、B（130/135 k Da,全长的未糖基化或去糖基化亚型或部分去糖基化亚型）、C/D（125/120 kDa,N端剪切加工亚型）。4.探明蛋白酶体及泛素化修饰对Nrf1的加工作用用不同浓度的三种蛋白酶体抑制剂（MG132、BTZ、Epox）处理人源或鼠源的8种细胞株后,经SDS-PAGE、NuPAGE胶分离后用三种Nrf1抗体检测发现,随着抑制剂浓度增加A+B、C+D亚型间的比率逐渐升高,表明蛋白酶体对内源性Nrf1确有剪切加工作用。然而,定点突变N端6个潜在的泛素化位点(K5、K6、K70、K169、K199、K205)后,发现泛素化虽然不是DDI加工的前提条件但可以影响Nrf1的稳定性,其中K5/6主要决定120 kDa糖基化亚型的蛋白水解加工过程。5.明确内源性Nrf1加工的影响因素及其应对不同浓度蛋白酶体抑制剂时的功能在HepG2细胞中用siRNA干扰p97、Hrd1、DDI-1、DDI-2、NGLY-1后,经免疫印迹检测发现内源性Nrf1各主要亚型受上述蛋白的影响,但均未有决定性作用。同时在敲除Nrf1的HepG2细胞中通过qPCR检测这些基因的变化情况,以及在高低剂量蛋白酶体抑制剂刺激中检测Nrf1、Nrf2对下游基因的活化能力,发现Nrf1与Nrf2可被不同程度地活化。其中,低浓度蛋白酶体抑制剂刺激时主要活化Nrf1,而在高浓度时其活性并不能进一步增加,Nrf2则呈现相反的作用,即主要在高浓度蛋白酶体抑制剂刺激时活化。通过上述方法对争议问题进行深入探讨,将使我们更加清晰地认识Nrf1的翻译后修饰加工机制,为针对Nrf1制定抗癌策略奠定理论基础,同时为研究其他跨膜转录因子提供方向。