当前,开发利用可再生能源已成为世界各国保障能源安全、加强环境保护、应对气候变化的重要措施。可再生能源是能源体系的重要组成部分,具有资源分布广、开发潜力大、环境影响小、可永续利用的特点,是有利于人与自然和谐发展的能源资源。随着经济社会的发展,我国能源需求持续增长,能源资源和环境问题日益突出,加快开发利用可再生能源是我国应对日益严峻的能源环境问题的必由之路也是实现能源可持续发展的必然选择。生物燃料乙醇,由于其独特的车用属性,是公认的很有发展前景的可再生生物能源之一。包括美国、巴西及欧盟在内的许多国家和地区都在大力发展生物燃料乙醇产业,我国也在《可再生能源中长期发展规划》及《可再生能源发展“十二五”规划》中将生物燃料乙醇列为重点发展及支持领域。由于我国可耕地面积少,以玉米、小麦、木薯、红薯等粮食及非粮淀粉为原料的第1、1.5代燃料乙醇生产不可避免地存在“与人争粮”“与粮争地”的问题,均不能大规模发展,政府对此进行了生产规模的限制。而以储量丰富廉价的可再生木质纤维素生物质为原料的第二代燃料乙醇生产被认为是可持续发展燃料乙醇的必然选择。以木质纤维素生物质为原料的二代燃料乙醇的生产包括原料的预处理,酶解释放可发酵性单糖以及微生物的乙醇发酵等步骤,各步骤均面临诸多困难且导致了乙醇生产成本的增加,不利于其与传统化石能源的竞争及大规模开发利用。其中实现木质纤维素生物质原料中的全糖(主要是葡萄糖及木糖)乙醇发酵是提高原料利用率降低生产成本的关键点之一。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的乙醇生产菌株,其具有较高的己糖发酵乙醇得率,且对多种工业条件下的抑制因素包括渗透压、乙醇等均具有较高的耐受性,因此也是二代燃料乙醇生产首选发酵微生物。但是,当发酵底物由淀粉类原料变为木质纤维素生物质为原料时候,酿酒酵母需要解决两方面的难题:首先,天然酿酒酵母不能很好的代谢木糖,而木糖是木质纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的单糖,对其有效的利用和发酵可以降低二代燃料乙醇的生产成本以提高其经济竞争力;另外,木质纤维素原料在预处理及酶解过程中,伴随着可发酵性糖的生成,也产生了大量的对微生物生长及发酵有抑制性作用的化合物,例如弱酸类、呋喃醛类及酚类化合物,这些化合物的存在抑制了酿酒酵母的生长及后续的乙醇发酵,延长发酵时间及降低了乙醇的生成速率,虽然可以利用生物、物理或化学方法对预处理原料进行脱毒处理,但这无疑增加了乙醇生产过程的复杂性及成本,同时也导致了可发酵性糖的损失,因此增加酿酒酵母自身对发酵过程中抑制物的耐受性从而提高乙醇的生成速率是解决这一问题的关键。所以,获得一株能高效共发酵葡萄糖和木糖同时也具有较高耐受性的酿酒酵母是第二代燃料乙醇的经济有效生产的前提和必要条件。为此,开展适于木质纤维素原料产业化乙醇生产酿酒酵母菌株的代谢工程改造的研究,主要工作包括:1、综合评价筛选适合二代燃料乙醇生产代谢工程改造的酿酒酵母受体菌株适宜本底遗传特性是构建优良的葡萄糖/木糖共发酵重组酿酒酵母菌株的前提。本文对实验室保存的32株野生型酿酒酵母,在分析其遗传倍性的基础上,进行多指标综合评估筛选:葡萄糖发酵乙醇得率、对多种抑制因子(高温、高渗透压力、氧化性胁迫、糠醛、乙酸、香草醛、乙醇等)耐受性的单因素检测;对混合有多种毒性化合物玉米秸秆预处理水解液的耐受性;通过在酿酒酵母染色体上整合初始木糖代谢途径,测定对木糖的本底利用能力。在所有评价的菌株中,分离于热带水果的二倍体野生型酿酒酵母菌株BSIF具有最高的葡萄糖发酵乙醇得率(限氧摇瓶发酵中,乙醇得率为0.451g g-1消耗葡萄糖);对多种单一抑制因素(高温、高渗透压、氧化性胁迫)及玉米秸秆预处理水解液具有较高耐受性;同时具有较好的本底代谢木糖产乙醇的能力。为此选择菌株BSIF作为代谢工程改造的受体菌株。2、理性代谢工程改造赋予野生型酿酒酵母木糖代谢能力野生型酿酒酵母菌株由于自身代谢木糖相关酶的活性不足,不能或仅少量非特异性利用木糖,但能代谢其异构体木酮糖。为此,根据代谢工程原理在筛选出的二倍体野生型酿酒酵母菌株BSIF中建立木糖代谢途径。木糖异构酶(xylose isomerase,XI)是自然界转化木糖到木酮糖的有效代谢途径,通过二轮定位整合方式,在二倍体菌株BSIF染色体的PHO13基因座位上插入具有自主知识产权的、克隆自牛瘤胃液宏基因组的木糖异构酶基因Ru-xylA (GenBank JF496707)三个串联的基因表达框,以实现木糖异构酶的异源表达,同时破坏了 PH013基因,减少无效循环导致ATP的浪费,基因型pho13::XI。继而为了强化自身下游代谢途径,在GRE3基因座位插入含有磷酸戊糖途径(PPP)非氧化部分的四个基因独立表达框,在超表达PPP途径的同时,使GRE3基因失活以减少副产物木糖醇的产生,基因型pho13::XI,gre3::PPP。木酮糖激酶是木糖代谢进入PPP途径的关键酶,该酶基因XKS1的适度超表达以增强下游代谢通量的同时,又不至于过度消耗ATP,为此通过在染色体上替换组成型强启动子TEF1p的策略来达到这一目的,基因型pho13::XI;gre3::PPP,XK。由于木糖异构酶催化的异构反应是酿酒酵母胞内木糖代谢的第一步,为了继续提高其酶活,进一步选用染色体重复序列的8-sequence座位进行三轮整合Ru-xylA基因表达框以提高其基因拷贝数,得到菌株BSN3 (pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP, XK)。对理性改造过程衍生出的各个菌株的基本性能测试列于下表,结果表明,己在二倍体野生型酿酒酵母菌株中建立了木糖代谢途径,且各种措施均有利于提高木糖代谢能力,而木糖异构酶的高活性更为关键。对混合糖(20 gL-1葡萄糖,20 gL-1木糖)的发酵,菌株BSN3在72h的木糖消耗量为18.22±0.24gL-1,且乙醇产生量也最高,为14.65g L-1。Table.理性代谢工程改造衍生菌株的特性3、非理性进化工程增强酿酒酵母木糖代谢能力通过理性代谢工程改造赋予了二倍体野生型酿酒酵母菌株BSIF木糖利用的能力,但得到的代谢工程菌株BSN3的木糖利用能力还有限。一般地,细胞内一些未知因素也会影响木糖到乙醇的转化率,为此继续对BSN3进行非理性进化工程改造。在木糖(20 g L-1)为唯一碳源的培养基中进行驯化培养,以细胞生物量倍增为转接指标,随着转接次数的增加,细胞在木糖培养基上生长逐渐好转,生物量倍增时间缩短,经过连续转接培养,生物量倍增时间稳定在大约120 min时,对培养液涂布平板分离单菌落,挑取近20个单菌落,在木糖(20 gL-1)为唯一碳源的液体培养基中测定比较最大比生长速率μmax,选择出生长最快的单菌落XH7 (pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP,XK, AE),用于开展下一步的菌株改造研究,结果表明,细胞在木糖上的长期驯化提高了木糖异构酶活性及木糖代谢能力,XH7的木糖异构酶比酶活提高至0.669±0.009 U mg-1 protein。同时在发酵罐限氧条件下,对木糖(40 gL-1)及混合糖(80g L-1葡萄糖,40g L-1木糖)的发酵,分别于26 h与40 h耗尽全部40 g L-1木糖,且具有较高乙醇得率。木糖代谢能力相比BSN3明显提高。4、非理性进化工程增强酿酒酵母抗逆能力在预处理玉米秸秆水解液中发酵,底物中抑制物及寡营养氮源对酵母发酵存在不利影响,虽然接种量的增加可以很大程度上弥补这种不利影响,但是从生产成本及竞争力方面考虑,依然需要酵母自身具有高抑制物耐受性。同时考虑到水解液中抑制物组分及其相互作用的复杂性以及酵母对其耐受性机制了解的不够透彻,因而以含有复合毒性化合物的玉米秸秆预处理沥出液作为驯化培养基,对XH7进一步驯化以提高细胞对水解液中抑制物的耐受性。以细胞生物量倍增为转接指标,经过约900小时的转接驯化培养,细胞生物量倍增时间从7h降至并维持在3.9h时,对培养液涂布平板分离单菌落,挑取近100个单菌落,利用BioScreen system (Oy Growth Curves Ab Ltd, Helsinki, Finland)对选取的单菌落的生长进行测定并选择比生长速率最大的菌落,命名为XHR11 (pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP,XK,AE-PCS)。对玉米秸秆预处理酶解液发酵结果表明,相比菌株XH7,XHR11对玉米秸秆水解液的耐受性明显提高,生物量提高了 3倍,且多消耗11.96 gL-1木糖,乙醇得率提高了 21.5 %。5、转运蛋白提高葡萄糖木糖共发酵能力糖转运环节是酿酒酵母糖代谢的第一步,重组酿酒酵母对木糖的转运是通过自身葡萄糖运输蛋白非特异性地完成,不仅效率低且受葡萄糖的抑制,影响木糖利用效率。而在酿酒酵母中表达异源高效戊糖转运蛋白,有利于提高戊糖的摄取效率,促进戊糖代谢能力。季也蒙酵母Mguilliermondii ATCC 6260的糖转运蛋白Mgt05196p的突变子N360S,是具有自主知识产权的、在酿酒酵母中能高效转运木糖的糖转运蛋白。为此,在菌株XHR11染色体上整合异源糖转运蛋白突变子N360S。由于受体菌株BSIF本底利用木糖的能力较强,测试结果表明转运蛋白N360S对重组菌株的木糖代谢能力没有明显的促进作用。但经过木糖(20 g L-1)为唯一碳源的培养基中短时驯化后,细胞生物量倍增时间进一步缩短,而同时对XHR11菌株的驯化,细胞生物量倍增时间没有变化。单菌落分离且进行性能比较后,得到菌株 LF1 (pho13:XI, 3δ::XI,gre3::PPP,XK, AE-PCS,N360S,AE)。菌株LF1发酵木糖(40 g L-1),12 h内耗尽全部木糖,发酵混合糖(80 g L-1葡萄糖和40 gL-1木糖),16 h耗尽全部糖分。菌株LF1对木糖发酵能力超过目前报道的最好水平。6、木质纤维素原料燃料乙醇生产的产业化推进收集各公司实际研发中用的不同木质纤维素原料的预处理水解液,这些原料的种类不同,预处理方式不同,因而释放的糖分及毒性成分与含量也不同。以这些产业化原料的乙醇发酵结果显示,在不同原料中,菌株LF1比XHR11利用木糖能力均有明显的提高。在山东泉林集团提供的水解液样本中,菌株LF1在20 h耗尽水解液中全部糖分(约40 g L-1 ),糖醇转化率为0.480,达到理论值的94.1 %。菌株LF1已具备木质纤维素原料燃料乙醇实际产业化潜力,但与各公司的实际不同上游预处理、酶解工艺路线的适配集成,仍需要进一步研究。