牵牛子杀灭鱼类指环虫活性成分的研究

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水产养殖业作为一项重要的经济产业,近年来发展迅速,集约化水平不断提高,与此同时,细菌性、病毒性及寄生虫感染等各类水产病害的发生,对渔业造成了很大的损失。指环虫是单殖吸虫纲的常见寄生虫,常附生在鱼的鳃瓣上,导致鳃畸形生长,当其密度过高时会导致鱼体死亡。国内外通常使用吡喹酮、甲苯咪唑、托曲珠利等防治指环虫病。这些化学药物的滥用已经导致了严重的抗药性,这就促使我们开发新型的抗寄生虫水产专用药。而植物源药物以其对环境友好等特点逐渐引起人们的关注。因此,从植物中寻找新型的水产专用药对未来水产养殖的可持续性发展具有重要的意义。本研究以中草药牵牛子为研究对象,开展了杀灭鱼类指环虫活性、活性成分跟踪分离、活性成分结构解析以及急性毒性评估等工作,取得了以下结果:1.牵牛子杀灭鱼类指环虫活性的研究。分别采用5种极性不同的溶剂:石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、水对牵牛子进行提取,结合活体杀虫活性检测,确定了其杀虫活性物质所在的极性段,结果表明:牵牛子甲醇提取物杀虫活性最高,是提取杀虫活性成分最主要的溶剂。当浓度为700.0mg L-1时对中型指环虫的48h杀灭率为100%,在400600.0mg L-1浓度范围内,其杀虫活性达到61.5%-82.4%。2.牵牛子杀灭鱼类指环虫活性成分的跟踪分离和结构鉴定的研究。将牵牛子甲醇提取物,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、水分别进行固液萃取,并结合杀虫活性检测,结果表明:甲醇萃取部分对指环虫具有很好的杀灭活性,与活性极性段测试结果相一致。进一步对甲醇萃取部分采用硅胶柱层析、C18层析柱、凝胶层析多级柱层析分离,每一步分离方法都以活性检测为指导,分离得到5个单体化合物(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ),其中化合物Ⅱ和Ⅳ,在浓度分别为11.2mg L-1和5.5mg L-1时,对指环虫的杀灭率达100%。通过波谱解析、结合相关文献,化合物Ⅱ和Ⅴ分别为棕榈酸(palmitic acid)和pharnilatin A;化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ分别鉴定为咖啡酸甲酯(caffeic acid methyl ester)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、12-羟基松香酸(12-hydroxyabietic acid),3种化合物在浓度分别为75mg L-1、25mg L-1、15mg L-1时,杀虫率均未超过50%。对2个高活性化合物进行杀灭指环虫的活性评估,结果表明:棕榈酸和pharnilatin A在48h对指环虫的半数有效浓度(EC50)分别为5.330mg L-1(4.806-5.925)和1.410mg L-1(1.138-1.735)。3.棕榈酸和pharnilatin A对鱼类急性毒性研究。以健康金鱼为实验动物,进行了急性毒性测定,结果表明:棕榈酸和pharnilatin A在48h对金鱼的半数致死浓度为(LC50)分别为:13.023mg L-1(12.443-13.508)和7.368mg L-1(6.763-7.931)。
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