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褐色桔蚜Aphis citricidus是柑桔的重要害虫,除直接刺吸柑桔的嫩梢、嫩叶造成危害外,还是柑桔衰退病病毒的主要传播媒介。褐色桔蚜与其他蚜虫一样具有翅二型现象,但相比于其他蚜虫,褐色桔蚜自然种群中的有翅率明显偏高,同时翅二型现象作为蚜虫重要的生态对策与其爆发成灾密切相关。因此,明确翅发育的分子调控机制,对蚜虫的持续控制具有重要的理论和实践意义。本研究采用转录组测序、数字基因表达谱分析和小RNA测序的方法,筛选出有翅成蚜与无翅成蚜差异表达关键基因ABCG4;采用活体饲喂miRNAs类似物和抑制剂、双荧光素酶报告系统以及RNA结合蛋白免疫沉淀方法明确miR-9b对ABCG4的靶向调控作用;利用RNAi技术分析胰岛素信号通路关键基因参与褐色桔蚜翅发育,以及miR-9b-ABCG4对褐色桔蚜胰岛素信号通路的转录调控关系,最终揭示了miR-9b-ABCG4-insulin调控褐色桔蚜翅发育的分子过程。本学位论文主要研究结果如下:1褐色桔蚜有翅型与无翅型差异表达基因及miRNAs筛选通过构建褐色桔蚜转录组总库,共鉴定获得44,199个Unigenes。进一步采用数字基因表达谱测序和小RNA测序的方法,筛选鉴定出褐色桔蚜有翅成蚜与无翅成蚜间5,749个差异表达的基因和6个差异表达的miRNAs,其中279个基因和4个miRNAs在有翅成蚜高表达,包括1个ABC转运蛋白基因ABCG4,且差异倍数较高。进一步利用RACE技术克隆获得了ABCG4的c DNA全长序列,通过5种miRNA-靶基因预测软件分析发现miR-9b、miR-10和miR-236可能是调控ABCG4表达的miRNAs。2 miR-9b调控ABCG4的表达通过饲喂人工合成的miRNAs类似物或抑制剂的方法分析发现,褐色桔蚜经饲喂miR-9b类似物后ABCG4的表达量显著下调,但饲喂miR-9b抑制剂后ABCG4的表达量显著上调,而饲喂miR-10和miR-236的类似物或抑制剂对ABCG4的表达均无显著影响。结果暗示miR-9b可能是调控ABCG4表达的miRNA。在离体水平上,采用双荧光素酶报告系统与基因定点突变的方法,分析miR-9b与ABCG4之间的靶向调控关系,证明miR-9b能够靶向ABCG4的ORF区域。在活体水平上,采用RNA结合蛋白免疫沉淀的方法,发现当miR-9b过表达时,Ago-1抗体富集的ABCG4 m RNA增多,说明miR-9b能够与ABCG4 m RNA结合。综合分析,通过活体饲喂miR-9b类似物或抑制剂、离体双荧光素酶报告系统以及活体RNA结合蛋白免疫沉淀证明miR-9b对褐色桔蚜ABCG4的表达具有调控作用。3 miR-9b-ABCG4对褐色桔蚜翅发育的影响利用q RT-PCR技术分析miR-9b和ABCG4在褐色桔蚜体内的时空表达模式,发现miR-9b与ABCG4在4龄有翅若虫至有翅成虫期的表达差异显著,且趋势相反,而在整个无翅蚜的不同发育阶段表达均较稳定。同时,miR-9b与ABCG4主要在脂肪体表达,在有翅成蚜期还在肌肉和翅部位有较高的表达水平。结果暗示miR-9b和ABCG4可能在4龄有翅若虫至成虫期具有较为关键的作用。利用RNAi技术,分析ABCG4对褐色桔蚜翅发育的影响。结果表明,饲喂ds ABCG4后能够特异地抑制其翅发育过程,出现翅卷曲或翅发育不完整的表型。同时,过表达miR-9b后出现与干扰ABCG4表达类似的表型,即翅发育不正常,但不影响蜕皮过程,而抑制miR-9b表达后无明显表型出现。同样,豌豆蚜饲喂miR-9b类似物和ds ABCG4也对翅发育造成特异性影响,说明miR-9b与ABCG4在蚜虫物种的靶向调控关系及生理功能可能一致。通过对miR-9b和ABCG4的时空表达模式解析,饲喂miR-9b类似物、抑制剂和ds ABCG4对褐色桔蚜和豌豆蚜的生理影响,发现miR-9b通过调控ABCG4的表达进而影响翅发育过程。4 miR-9b-ABCG4-insulin调控褐色桔蚜翅发育的分子机制利用RNAi技术,干扰褐色桔蚜2条胰岛素受体基因表达后,试虫均出现一定比例的翅发育不正常的表型。解析胰岛素信号通路3个胰岛素样肽基因在褐色桔蚜体内的时空表达模式,发现IRP1在CNS高表达,而IRP3和IRP5则是在脂肪体高表达。干扰IRP3表达后出现翅发育畸形的表型,并且干扰ABCG4后引起IRP3表达下调,干扰IRP3表达后能够反馈调节ABCG4的表达,使其表达量上调。另外检测干扰ABCG4和miR-9b以及过表达miR-9b对胰岛素信号通路基因表达量的影响,结果发现干扰ABCG4与过表达miR-9b后胰岛素信号通路基因的表达量均显著下调;相反,干扰miR-9b后,该通路基因的表达量均上调。进一步分析牛胰岛素是否能挽救由于干扰ABCG4造成的翅发育畸形的表型,发现直接饲喂牛胰岛素后IRP3基因的表达量显著上调,且ABCG4的表达量下降;混合饲喂牛胰岛素和ds ABCG4后,褐色桔蚜的翅发育均恢复正常。综合分析上述研究结果,证明褐色桔蚜miR-9b负向调控ABCG4的表达,ABCG4通过调控IRP3的表达影响胰岛素信号通路的活性从而调控翅的发育。