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研究背景:骨作为一种器官具有显著的再生特性,然而,骨的再生是细胞、血管基质和生长因子共同作用的复杂结果。骨组织工程包括合适的种子细胞、可降解的支架材料以及生长因子三个要素。其最新研究表明,由外泌体(exosomes,EXOs)、脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)及丝素-壳聚糖三维支架(Silk fibroin-chitosan 3D scaffold,SF-CS)构成的复合物有望为解决临床骨缺损的修复提供新的思路。目的:验证丝素-壳聚糖三维多孔支架与脂肪干细胞体外构建细胞-支架复合物的可行性,探究成骨分化脂肪干细胞来源的外泌体对脂肪干细胞-丝素/壳聚糖三维支架(ADSCs-SF/CS)复合物成骨效应的影响。方法:1、提取人脂肪干细胞,进行体外分离培养及鉴定。2、制备丝素-壳聚糖三维多孔支架。3、对脂肪干细胞进行成骨诱导培养,超速离心法提取细胞上清液中的外泌体。4、制备ADSCs-SF/CS复合物,扫描电镜下观察细胞-支架复合物的外观和内部结构。5、将ADSCs-SF/CS复合物分为普通培养液组、成骨诱导液组、普通培养液加外泌体组、成骨诱导液加外泌体组,连续培养14天后,运用Western Blot方法检测成骨相关蛋白Runx2的表达量以证实脂肪干细胞成骨分化,并通过CCK-8法及ALP活性检测探究外泌体对ADSCs-SF/CS复合物成骨效应的影响。结果:所提取干细胞经完全培养基培养长势良好,经成骨、成脂及成软骨诱导并染色鉴定,证实所培养细胞为脂肪干细胞。冷冻干燥法制作完成的丝素-壳聚糖支架外表为乳白色,大体观呈海绵状,质软且有弹性。扫描电镜观察结果显示人脂肪干细胞可以在丝素-壳聚糖支架上粘附生长。超速离心法提取的细胞上清液中的小囊泡经过透射电镜观察及western鉴定CD9和CD63蛋白,证实为诱导后成骨分化的脂肪干细胞来源的外泌体,将外泌体与ADSCs-SF/CS复合物共培养,通过检测成骨相关蛋白Runx2及测定CCK-8和ALP活性,与对照组相比加入外泌体可使ADSCs-SF/CS复合物成骨效应显著增强结论:丝素-壳聚糖复合支架的多孔三维立体结构为细胞的粘附增殖提供了良好的微环境,其与人脂肪干细胞体外构建细胞-支架复合物方法可行,可以作为骨组织工程骨的人工骨支架应用于临床;成骨分化的脂肪干细胞来源的外泌体可诱导附着于丝素-壳聚糖支架上的脂肪干细胞向成骨细胞分化,并且对脂肪干细胞的成骨具有促进效应。