研究背景近年来,视网膜变性疾病,包括年龄相关性黄斑变性,视网膜色素变性等,发病率逐渐升高,是主要的致盲性疾病。这些疾病都是以进行性色素上皮细胞(retinal pigment epitheium, RPE)、光感受器细胞的功能丧失,凋亡或坏死为特点,造成视力不可逆的损害。正常的RPE是具有极性的单层细胞,位于视网膜的最外层。它是代谢高度活跃的细胞层,主要支持感光细胞层。主要功能包括转运营养物质,视黄醇回收利用,产生色素以及吞噬视锥、视杆细胞外节。RPE在其细胞顶面分泌色素上皮衍生生长因子(pigment epitheliumderived epitheliumderived growth factor, PEDF),基底侧分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。每个细胞与Bruch膜紧密相连,相邻细胞间的紧密联系构成了血视网膜屏障。在湿性AMD中,由于RPE的功能失调,屏障功能的损坏,异常的新生血管由脉络膜发出,穿过玻璃膜和视网膜色素上皮到达视网膜下,形成脉络膜新生血管,继而引发出血及瘢痕的形成,破坏了正常的视网膜组织,引起视力的丢失。在干性AMD中,RPE的功能丧失、凋亡最终导致了黄斑部位光感受器的丧失,从而导致视力的缺损。虽然营养及抗氧化的药物治疗,或在湿性AMD中,玻璃体内注射抗VEGF因子能减缓疾病的进展,但没能替换掉RPE或感光细胞从而逆转AMD病程。鉴于病变的RPE是AMD主要的病变部位,通过手术的方式替换掉黄斑部的病变的RPE应该有效。目前主要有黄斑转位手术和RPE自体移植术,前者是将黄斑区神经视网膜层转移到周边健康的RPE区域,后者则是将外周相对健康的RPE-脉络膜植片移植至黄斑区,这两种手术方式已在部分病例中被采用,在长期的随访中均被证实可维持或提高患者的视力。然而上述两种手术存在创伤大、操作复杂,并发症多的缺点,难于在临床上推广使用,另外,这些手术方法仅能对RPE的损害有效,对于黄斑光感受器严重受损的病例则难于发挥作用。因此寻找一种操作简单,便于推广、创伤伤小的细胞替代方法越来越受到关注。干细胞是一群具有自我更新及多向潜能的细胞群。利用干细胞的可塑性,定向分化为目的细胞进行细胞移植或利用干细胞的分泌细胞因子修复受损的视网膜及RPE,已经成为视网膜变性疾病治疗的研究热点。干细胞研究主要分为两大类,胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞分化潜能强,可以向内,中,外三个胚层的组织分化。但是免疫排斥的问题及伦理道德的问题限制其广泛的应用。成体干细胞,也具有多向分化的潜能,取材容易,无伦理道德问题,成为近年来研究的热点。应用于视网膜疾病治疗实验研究的成体干细胞主要有：视网膜干细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)脑源性干细胞等。相比于其他干细胞,BMSCs具有以下优点：1)BMSCs也具有向三个胚层的组织细胞分化的能力,如骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞等；2)取材容易,易于扩增,无伦理道德的问题；3)具有强大的旁分泌作用,分泌神经营养因子和生长因子促进损伤组织的修复；4)具有免疫调节及抑制炎症因子释放的作用,有利于同种异体的移植,减少免疫排斥药物的使用；5)主动向损伤组织区域迁移的作用；6)移植后无肿瘤形成的倾向。这些优点使得BMSCs移植视网膜变性疾病治疗研究中备受关注。已经有体外实验中表明,BMSCs在活化素A、牛磺酸和表皮生长因子的诱导作用下能表达感光细胞特异性标记物视紫质、视蛋白等。将BMSCs视网膜色素上皮细胞共培养后,可观察至BMSCs向RPE分化,呈现出RPE的形态,细胞内具有颗粒,表达RPE的标志物-细胞角蛋白表达。这些研究均提示,BMSCs在微环境的作用下有向视网膜细胞分化的潜能。如何将干细胞移植到视网膜下,并使其在视网膜下能维持更多地活细胞数量,并能在局部微环境作用下向REP或光感受器细胞分化,是细胞移植治疗中的一个关键问题。目前文献上报道细胞移植途径主要有眼局部注射和全身静脉注射两大类。前者又包括视网膜下注射和玻璃体腔注射。这几种移植方式各有优缺点.(1)视网膜下注射：直接把细胞注射移植到靶部位即RPE层与感光细胞层之间。尽管受到体积限制,单次注射的细胞数量偏少,但是所注射的细胞都能进入视网膜下,只要有足够的活细胞数量并在局部微环境的状态下能向RPE及视网膜光感受器细胞分化,便有可能发挥细胞替代作用,因此应是最理想的移植方法。不足之处在于视网膜下移植操作较复杂,会引起视网膜出血及视网膜脱离等损伤.(2)经玻璃体腔注射移植：将细胞悬液注射到玻璃体腔中,较视网膜下注射操作相对简单,对视网膜造成的损伤较小。然而移植的干细胞需要通过玻璃体腔迁移到视网膜内。由于内界膜的阻碍,只有不到1%的细胞能到达视网膜内。在不同的疾病实验动物模型研究中,细胞能否进入视网膜下或在向视网膜下迁移的过程中分化情况,报道结果也各有不同。(3)静脉注射：将细胞悬液注射到静脉中,细胞通过体循环到达眼部,并迁移至视网膜下或视网膜内。该方法的优点是操作简单,便于反复注射,不受注射容积的限制,但是存在诱导血栓形成及过敏的风险。最大的问题在于,细胞经过全身循环后能否到达视网膜附近存在争议；有研究者认为,体循环中的细胞难以通过血眼屏障,不能在靶位聚集足够量的活细胞发挥作用；然而部分研究者提出在视网膜色素变性及AMD等病理状态下,视网膜屏障功能并不完整,细胞可以到达视网膜下。通过改变干细胞表位抗原决定簇,使其对视网膜组织有特殊的亲和力,可达到足够多的活细胞量。本文旨在比较通过不同的方式将BMSCs移植到大鼠视网膜下,探索在不同方式下,BMSCs在眼部微环境的作用下的存活及分化情况,为BMSCs移植治疗视网膜变性疾病的进一步研究提供实验依据。目的通过视网膜下注射、玻璃体腔注射将BMSCs移植到正常SD大鼠的眼内,尾静脉注射将MSCs移植到大鼠体内,观察MSCs通过这三种途径细胞在正常大鼠的视网膜下及周围的分布、存活和分化情况。方法取3-4周龄的SD大鼠的骨髓,采用全骨髓贴壁筛选培养法分离、获得正常SD大鼠的BMSCs,取第4代的培养的MSCs,经过流式细胞仪鉴定培养的细胞表面标志物-CD29、CD44、CD45表达情况,证实本实验培养获得的细胞符合MSCs的特征后,采用携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的腺病毒感染BMSCs,使EGFP在MSCs内表达,从而获得标记。然后将EGFP标记的MSCs,配制成5*104个细胞/ml的细胞悬液,通过视网膜下注射、玻璃腔注射将细胞移植到正常SD大鼠的眼内,尾静脉注射将MSCs移植到大鼠体内。将51只正常6-SD大鼠分为视网膜下注射组(A组,15只),玻璃体腔注射组(B组,15只),尾静脉注射组(C组,21只)。A组大鼠的右眼作为实验眼,用33G锐针头在睫状体平坦部刺入,换用34G钝针头到达视网膜下,向视网膜下腔内注入2u1MSCs细胞悬液,共计1*105个细胞/眼,左眼作为对照眼,向视网膜下腔内注入等量L-DMEM。B组大鼠的右眼作为实验眼,用33G锐针头在睫状体平坦部刺入,直接到达眼内,向玻璃体腔内注入2ulMSCs细胞悬液,共计1*105个细胞/眼,左眼作为对照眼,玻璃体腔内注入等量L-DMEM。若发生视网膜下大出血或玻璃体出血的大鼠弃去不用。C组中随机取15只作为实验组通过尾静脉注射1mlMSCs细胞悬液到大鼠体内,共计5*107个细胞/鼠,6只作为对照组注射等量生理盐水。分别于术后3天、7天及21天处死一批大鼠,摘取大鼠的眼球,进行连续冰冻切片,在荧光显微镜下直接观察不同组的移植MSCs细胞在眼内的分布情况,并用小鼠抗大鼠Rhodopsin单抗、小鼠抗大鼠RPE65(retinal pigment epithelium, RPE)单抗、兔抗大鼠的GFAP(glial fibrillary acidic protein, GFAP)单抗及Cy3标记的二抗进行双重荧光染色,观察MSCs在眼内的微环境中的存活、分化情况。结果(1)采用全骨髓培养法分离获得MSCs,细胞表面标志物CD29、CD44、CD45为94.2%,98.9%、0.9%,符合MSCs鉴定的标准。(2)MSCs经EGFP-腺病毒转染后,在荧光显微镜下观察,发绿色荧光,经流式细胞仪检测,EGFP阳性的MSCs比例为73.66%。(3)在视网膜下移植的实验眼球切片中,可以见到大量MSCs细胞存活于视网膜下间隙内,术后21天时,细胞仍然存活于移植部位,未见明显向远处迁移,部分细胞表达神经胶质细胞标志物,未见表达感光细胞、RPE、神经胶质细胞等标志物。在玻璃体腔移植的实验眼球切片中,可以见到MSCs细胞存活于玻璃体腔内,直至术后21天时,细胞仍在玻璃体腔存活,未见细胞向视网膜内迁移到达视网膜下区域,不表达感光细胞、RPE、神经胶质细胞等标志物。在尾静脉移植的实验眼球切片中,未见有MSCs进入视网膜下区域及眼内。结论通过视网膜下移植及玻璃腔移植均可以将MSCs移植于眼内,视网膜下移植的细胞可以达到视网膜下区域,细胞可以存活达3周,部分细胞向神经胶质细胞分化,未见细胞向RPE及感光细胞分化。移植于玻璃体腔的细胞不能突破内界膜迁移至视网膜下,未见细胞向视网膜细胞分化。尾静脉注射的MSCs,未见透过血-眼屏障进入视网膜下。