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百合(Lilium spp.)是重要的商品球根花卉,根据不同的观赏用途,百合分为切花植株,盆栽植株和庭院植株。市场上每年都会出现新的切花品种,然而盆栽百合品种却相对稀缺。株高是限制盆栽百合的发展的一个主要因素。生产中常用的调控百合株高的方法是施用植物生长延缓剂,但植物生长延缓剂引起的矮化效应不能遗传且受到植物种类、施用时间、施用浓度以及外界环境等因素影响。随着基因工程技术的发展,基因工程矮化育种将可能成为替代植物生长延缓剂的一种有效的方法,实现该目标的前提是分离有效的矮化基因和构建高效的百合遗传转化体系。本研究以LA杂交百合(Lilium Longiflorum×Asiatichybrid lily)品种‘耀眼’做为实验材料,分析植物生长延缓剂多效唑(PBZ)对百合的矮化效应,利用Illumina平台进行百合转录组测序,筛选与百合矮化相关的基因,利用RACE技术克隆2个GA20ox基因和1个GA2ox基因并构建GA2ox基因过表达载体,同时探索了岷江百合和铁炮百合的遗传转化体系。本研究旨在探索百合矮化基因工程育种,为培育盆栽百合新品种提供基因资源和技术支撑。主要研究结果如下: (1)采用不同浓度(0、100、300和500 mg/L)的PBZ对幼苗期的LA百合进行叶面喷施,观察植株的茎、叶、根和花四个器官的形态变化及茎叶细胞显微结构,并检测其叶绿素含量。结果显示,茎和叶随着PBZ浓度增加,其生长抑制增强。根的生长发育被低浓度PBZ促进,但受到高浓度PBZ的抑制。而开花数,花大小,初花期以及叶绿素含量都不受PBZ影响。叶片和茎的显微结果显示500 mg/L PBZ喷施叶片后,导致百合叶和茎细胞都缩短。 (2)利用Illumina测序平台对500 mg/L PBZ处理0h、3h、24 h和72 h的LA百合叶片的转录组进行测序,约产生38.6 Gb的数据,组装得到53,681条unigene,平均长度849 bp。其中,有38,507条(71.73%)的unigene比对到已知蛋白数据库中,获得功能注释。在这些获得成功注释的基因中,有25,092条(46.74%) unigene比对到KEGG数据库中,参与了128条细胞代谢通路。17,201unigene(32.04%)比对到COG数据库的25个功能类别中。利用MISA软件分析所有unigene得到3,604个SSR,主要重复类型是三核苷酸重复基元和二核苷酸重复基元,主要类型分别是GCC/GGC和AG/CT。 (3)比较PBZ处理组和未处理组之间所有转录本的表达水平筛选获到2,704差异表达基因。KEGG富集显示9个代谢通路及信号转导通路显著富集,它们涉及基因表达,蛋白、激素及次生代谢物合成,物质转运及对环境刺激应答等植物生长发育的多个生理过程。对参与细胞分裂和细胞扩张过程的基因进行筛选获得50个差异表达基因。其中9个基因参与细胞分裂过程,受PBZ调控以下调表达为主。41个基因参与细胞扩张过程,其中参与细胞膨压,胞质生长和细胞壁松弛的基因表达受PBZ调控以下调为主,而参与细胞壁固化的基因表达模式较为复杂。分析GA代谢途径和信号转导途径中差异表达基因的表达模式表明PBZ引起了GA代谢途径和信号转导途径的反馈机制,分析其它物种中的这些同源基因的生物功能,推测这些基因参与百合株型调控,为百合矮化遗传育种提供了有价值的基因资源。 (4)基于转录测序获得的GA20ox和GA2ox基因的部分序列信息,采用RACE技术克隆得到2个GA20ox基因和1个GA2ox基因的cDNA全长序列。氨基酸序列分析显示三个基因的氨基酸序列都含有一个2-氧化戊二酸/铁(Ⅱ)依赖性双加氧酶保守结构域,且它们分别与其它物种中GA20ox和GA2ox编码的氨基酸序列有较高的相似性,表明它们属于GA20ox和GA2ox基因家族。此外,还构建了GA2ox基因过表达载体构建,为通过转基因技术研究GA2ox对百合株型调控功能奠定基础。 (5)以岷江百合和铁炮百合鳞片为外植体,首先确定了两种百合适宜的芽诱导培养基为:MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L。然后筛选了岷江百合鳞片农杆菌介导的转化体系中除菌剂为200 mg/L头孢霉素,筛选压为40 mg/L潮霉素;铁炮百合鳞片农杆菌介导的转化体系中除菌剂为200 mg/L替卡西林钠克拉维酸钾,筛选压为35 mg/L潮霉素。最后研究证明去除共培养培养基中的NH4NO3促进岷江百合转化效率,并初步得到岷江百合的转化体系为:在适宜的芽诱导培养基中预培养2天,浸染菌液OD600值为0.5左右,浸染时间15 min,在去除NH4NO3的MS培养基上共培养1天(培养时间根据农杆菌生长情况确定)后,向分化培养基中加入200 mg/L头孢霉素和40 mg/L潮霉素除去农杆菌并筛选抗性芽,最终通过PCR检测获得2株转化植株。