论文部分内容阅读
GABAB受体属于G蛋白偶联受体C家族，主要分布在中枢神经系统和外周神经系统中。GABAB受体通过与其配体GABA结合，介导缓慢而持久的抑制性神经信号。过度激活或抑制受体，都会引起如认知、疼痛、焦虑、抑郁、癫痫、药物成瘾、精神分裂等疾病的发生。GABAB受体由于其复杂的结构、精细的激活机制和疾病的相关性，被认为是最有药理学意义的药物靶点。针对GABAB受体为靶点的药物开发主要集中于受体的激动剂、拮抗剂以及变构剂。开发GABAB受体特异性的调节剂，有利于GABAB受体的生理病理的研究，促进相关疾病的治疗。以GABAB受体为靶点的高通量药物筛选模型的建立，有利于筛选出GABAB受体的特异性调节剂，作为先导药物分子，为后续相关药物的开发提供基础，提高了药物开发的效率和速度。 本文主要以GABAB受体为药物靶点，建立基于该靶点的高通量药物筛选模型。将本实验室构建的Gqi9片段重组到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中，得到的重组质粒再转染到本实验室已有的稳定表达GABAB受体的Flp-in CHO细胞系中，利用抗生素筛选及Ca2+信号检测的方法，得到了GABAB受体和Gqi9共表达的稳定细胞系。并使用该受体的配体GABA和拮抗剂CGP54626对其进行了功能验证以及稳定性检测等。最终获得了可以共表达GABAB受体和Gqi9的稳定高通量药物筛选模型。此外，也将时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET）应用于药物筛选中，建立基于SNAP和CLIP标记的TR-FRET检测的GABAB受体药物筛选模型。将SNAP标记的GB1和CLIP标记的GB2以及SNAP-GB1和GB2 C-tail带有内质网滞留信号KKTN的SNAP-GB2-KKTN，分别转染到Flp-inCHO细胞中，通过抗生素筛选、ELISA和Ca2+信号检测的方法，获得了一些既能上膜表达又能激活下游Ca2+信号的SNAP-GB1+CLIP-GB2和SNAP-GB1+CLIP-GB2-KKTN的克隆，用于下一步TR-FRET检测，最终建立成基于GABAB受体的高通量药物筛选模型。本文建立的三个以GABAB受体为靶点的高通量稳定药物筛选模型，为筛选小分子活性化合物提供了工具，为神经方面药物的开发提供了基础。