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第一章 miRNA-125a抑制喉癌细胞增殖的研究研究目的本课题组前期研究初步发现过表达的miRNA-125a可以抑制喉癌Hep2细胞株的增殖。本章研究通过一系列体外细胞功能试验进一步深入研究miRNA-125a对喉癌Hep2及FaDu细胞株增殖的影响,寻找其可能的靶基因。方法喉癌Hep2及FaDu细胞株,分别转染miRNA-125a模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)。应用克隆形成实验、软琼脂集落形成实验观察miRNA-125a过表达或抑制对喉癌Hep2及FaDu细胞增殖的影响;通过Brdu、流式细胞术等实验分析miRNA-125a过表达或抑制对喉癌Hep2及FaDu细胞周期的影响;综合运用了 western blot、qRT-PCR技术和双荧光素酶活性测定实验研究喉癌细胞中miR-125a对于可能的靶基因的调控作用;最后在细胞水平通过MTT实验、克隆形成实验和软琼脂集落形成实验观察沉默表达靶基因ErbB3后细胞增殖能力的变化。结果 克隆形成实验、软琼脂集落形成实验均提示miRNA-125a表达对喉癌Hep2及FaDu细胞增殖能力有显著的抑制作用;Brdu实验表明miR-125a可降低喉癌Hep2及FaDu细胞株中S期细胞的比例,提示miR-125a可能通过阻滞细胞周期,抑制喉癌细胞增殖;流式细胞术结果提示miR-125a可使喉癌Hep2及FaDu细胞株停滞在GO/G1期,S期和G2/M期细胞减少;通过western blot、qRT-PCR技术和双荧光素酶活性测定等,我们发现miR-125a对ErbB3有直接的负调控作用,miR-125a能够显著抑制ErbB3的表达水平从而抑制喉癌细胞的增殖作用。最后我们再用MTT实验、克隆形成实验、软琼脂集落形成实验验证了转染miR-125a-inhibitor,沉默表达靶基因ErbB3后相比于表达组,对喉癌细胞增殖作用明显受到抑制。结论 miR-125a在喉癌组织中表达下调,提示了其在喉癌可能发挥抑癌基因的作用;miR-125a可能是通过作用于其下游的靶基因ErbB3对喉癌的增殖起抑制作用;miR-125a可能通过影响细胞周期从而抑制喉癌细胞的增殖。第二章利用基因芯片技术筛选喉癌淋巴结转移相关miRNAs差异表达谱研究目的 应用miRNA芯片筛选与喉鳞癌淋巴结转移相关的差异miRNAs,为喉癌转移相关研究提供新的方向。方法 收集有淋巴结转移组和无转移组喉鳞癌组织各5例,对该10个标本进行miRNA微阵列基因芯片分析,获得有淋巴结转移组和无转移组的喉癌组织中的miRNA差异表达谱。采用芯片显著性分析软件(SAM)筛选出有无淋巴结转移的喉鳞癌组织中表达有显著性差异的miRNA。结果 筛选出和无淋巴结转移组相比,有淋巴结转移的肿瘤组织中共有22个miRNA表达显著上调,387个miRNA表达显著下调。结论 有淋巴结转移组和无转移组喉鳞癌存在明显的miRNA差异表达,这些差异表达的miRNA在喉癌的转移和进展中可能发挥重要作用,为喉癌转移相关研究奠定初步基础。第三章 应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对基因芯片分析结果进行验证研究目的 应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对基因芯片筛选出来的喉鳞癌淋巴结转移相关的差异miRNAs进行验证。方法 随机选取在广东省人民医院标本库中40例原发性喉鳞癌组织,20例有淋巴结转移、20例无淋巴结转移配对,采用qRT-PCR实验,以U6为内参,检测miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203 在 40 例喉鳞癌组织中的表达水平。结果 qRT-PCR结果验证了在喉鳞癌组织中miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203表达水平均显著下调,且在有无淋巴结转移的喉癌组织中表达差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203在喉鳞癌的淋巴结转移组和无转移组间有显著性差异,可能与喉鳞癌的淋巴结转移相关,为进一步研究喉鳞癌淋巴结转移奠定初步的分子生物学基础。