论文部分内容阅读
目的:心肌缺血是指各种原因导致冠状动脉血流量减少,从而引起心肌细胞氧等物质供应减少以及清除代谢产物能力降低的一种临床病理生理状态,在临床上多见于冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病),又称为缺血性心脏病。近年来,随着我国经济的快速发展,人们生活水准极大地提高,以及饮食结构的改变和人均期望寿命的延长,使我国缺血性心脏病发生率逐年上升,成为国人死亡的主要原因之一。因此寻找和探索有效防治缺血性心脏病的方法成为广大医学界研究的重点和热点。现有研究针刺改善心肌缺血多选取单穴,其中以内关、心俞为主要研究穴位,大多数并未考虑辨证论治施来加以配穴。多个穴位联合效应的产生机制以及其效应是否优于单个腧穴,需要更进一步的探讨研究。本研究以慢性心肌缺血大鼠模型为研究对象,采用“标本配穴”电针进行针刺治疗,并以单取“内关穴”作为对照,通过观察心电图、心肌病理形态学、心肌梗死面积、细胞凋亡指数及线粒体超微结构的变化,分析“标本配穴”治疗对心肌缺血大鼠的保护作用,通过对PI3K/Akt通路的激活和抑制,观察PI3K/Akt通路及凋亡相关基因、蛋白等指标的变化,系统整理和分析“标本配穴”对慢性心肌缺血大鼠PI3K/Akt信号通路及相关基因、蛋白表达的调控作用机制,探讨“标本配穴”对慢性心肌缺血的保护作用及其机制,为临床腧穴配伍提供实验依据。材料与方法:采用3月龄SPF级Wistar雄性健康大鼠140只,体重180-220g,根据随机数字表法分为7组:正常组、模型组、LY294002组、IGF-1组、内关组、标本配穴组、标本配穴+LY294002组,每组20只,分笼饲养,常规饮食,适应性喂养一周后进行造模及处理。除正常组外,其余6组均采用腹部皮下注射盐酸异丙肾上腺素(ISO)方法复制成慢性心肌缺血模型,共注射14天,每天1次。LY294002组和标本配穴+LY294002组除造模外,还给予PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002溶液进行腹部皮下注射,自造模开始至造模结束,一共14天,每天一次。IGF-1组除造模外,另给予PI3K/Akt通路激活剂胰岛素一号增长因子(IGF-1)进行腹部皮下注射,也自造模开始至造模结束,一共14天,每天一次。内关组除造模外,单取“内关穴”进行电针治疗(在“内关穴”右侧旁开0.5cm处再浅刺一针作为辅助电极);标本配穴组和标本配穴+LY294002组则取“内关穴”、“足三里穴”、“关元穴”进行电针治疗(同侧“内关穴”接同侧“足三里穴”,在“关元穴”右侧旁开0.5cm处再浅刺一针作为辅助电极)。电针治疗接HANS-200型电针仪,连续波,频率2HZ,强度1m A,以大鼠肢体微微颤动为度,自造模开始,每天治疗一次,每次10min,共持续21天。针刺结束后,采用BL-420S生物机能实验系统软件检测各组大鼠心率(HR)、ST段变化。采用HE染色法观察大鼠心肌组织病理形态学的变化。通过TTC染色法检测大鼠心肌梗死面积。Tunel法检测大鼠心肌细胞凋亡指数。采用电镜观察大鼠心肌线粒体结构变化。免疫组化发检测大鼠心肌组织PI3K、Akt、Caspase3、Caspase9、Bax、Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达水平。采用RT-PCR(Real time-PCR)检测大鼠心肌组织PI3K、Aktm RNA的表达水平,同时采用免疫印迹法(Westernblot)检测PI3K、Akt蛋白的表达。结果:1.干预前各组之间HR、ST段电压两两比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),组间具有可比性。除正常组,其余各组干预后较干预前HR增快、ST段电压抬高,差异均有极显著性统计学意义(均P<0.01)。干预后,与正常组比较,各组HR增快、ST段电压抬高极为明显(均P<0.01)。与模型组比较,IGF-1组、内关组和标本配穴组HR减慢、ST段电压下降明显(均P<0.01);LY294002组HR增快(P<0.05),ST段电压增高(P<0.01);标本配穴+LY294002组HR、ST段电压差异无统计学意义(P>0.05)。与标本配穴组比,LY294002组和标本配穴+LY294002组HR、ST段电压高于标本配穴组(均P<0.01);IGF-1组与标本配穴组比较,HR、ST段电压差异无统计学意义(P>0.05);内关组较标本配穴组HR增快、ST段电压抬高(P<0.05)。2.光镜下心肌组织HE染色可见,正常组心肌纤维紧凑,排列整齐,细胞核清晰可见,红色为肌纤维,蓝色为细胞核;模型组显示心肌受损时心肌细胞肥大,肌浆凝聚,呈强嗜酸性染色(深红),部分崩碎成不规则的粗颗粒或团块,心肌纤维排列紊乱、扭曲、断裂,肌纤维间隙增宽,局部纤维化,细胞核破裂、溶解,分散混乱,坏死面积超过心脏厚度的1/2;LY294002组和标本配穴+LY294002组心肌损伤比模型组更重。经电针治疗后标本配穴组和内关组心肌损伤明显减轻,且标本配穴组改善程度优于内关组,与IGF-1组改善程度相一致。3.与正常组相比,其他各组IS/LV和ARR/LV均明显增高,差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,IGF-1组、内关组和标本配穴组的IS/LV和ARR/LV均有所下降,差异有显著性意义(P<0.01);LY294002组和标本配穴+LY294002组的IS/LV和ARR/LV明显升高,差异有统计学意义(P<0.01或<0.05)。与标本配穴组比较,IGF组IS/LV和ARR/LV有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05);内关组、LY294002组和标本配穴+LY294002组的IS/LV和ARR/LV比值高于标本配穴组,差异有显著性意义(P<0.01)。4.与正常组相比,其他各组心肌细胞凋亡指数(Apoptotic Index,AI)均明显增高,差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,IGF-1组、内关组和标本配穴组的AI均有所下降,差异有显著性意义(P<0.01);LY294002组和标本配穴+LY294002组的AI明显升高,差异有统计学意义(P<0.01或<0.05)。与标本配穴组比较,IGF组AI有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05);内关组、LY294002组和标本配穴+LY294002组的AI比值高于标本配穴组,差异有显著性意义(P<0.01)。5.正常组心肌肌原纤维平行排列整齐,肌丝清晰;线粒体较丰富,形态一致,呈椭圆形,结构完整,岭饱满,无线粒体肿胀和空泡样变性;线粒体嵴数目较多,呈板层状形态,嵴突呈大致平行片层状排列;细胞核和核仁显示良好。模型组:心肌细胞损伤较重,细胞质内水肿明显,肌丝溶解,线粒体水肿、空泡变、灶性空化,嵴断裂、紊乱并数目明显减少,形成很宽的电子高透亮区;基质电子密度低、致密颗粒减少甚或消失,伴随空泡样区域形成;肌小节断裂,肌原纤维排列紊乱,部分Z线不明显;细胞核染色体固缩、边聚,形成新月体形,可见到典型的早期凋亡小体。LY294002组和标本配穴+LY294002组线粒体损伤程度相似。经电针治疗后,标本配穴组和内关组心肌线粒体损伤程度改善,且标本配穴组改善程度优于内关组,并与IGF-1组线粒体改善程度一致。6.与正常组相比,各组大鼠心肌组织内Caspase3、Caspase9和Bax蛋白表达均有不同程度升高,差异有显著性意义(P<0.01),说明造模后心肌出现不同程度细胞凋亡,造模成功。与模型组相比,标本配穴+LY294022组Caspase3、Caspase9和Bax蛋白表达与模型组相比无明显差异(P>0.05);LY294002组Caspase3、Caspase9和Bax蛋白表达更明显(P<0.05),说明细胞凋亡程度更重;IGF-1组、内关组和标本配穴组的Caspase3、Caspase9和Bax蛋白表达较模型组不同程度下降(P<0.01或0.05),说明这三组大鼠心肌细胞凋亡程度轻于模型组。与标本配穴组比,内关组、LY294002组和标本配穴+LY294002组Caspase3、Caspase9和Bax蛋白表达均不同程度升高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01),说明标本配穴组心肌细胞凋亡程度低于这三组;IGF-1组Caspase3、Caspase9和Bax蛋白表达与标本配穴组比较无明显差异(P>0.05),说明两组心肌细胞凋亡程度几乎一致。7.与正常组相比,各组大鼠心肌组织内Bcl-2蛋白表达均有不同程度升高,差异有显著性意义(P<0.01)。与模型组相比,标本配穴+LY294002组Bcl-2蛋白表达稍高于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05);LY294002组Bcl-2蛋白表达低于模型组,差异显著(P<0.01);IGF-1组、内关组和标本配穴组的Bcl-2蛋白表达较模型组不同程度升高(P<0.01或0.05)。与标本配穴组比,内关组、LY294002组和标本配穴+LY294002组Bcl-2蛋白表达低于标本配穴组,差异有统计学意义(P<0.05或0.01);IGF-1组Bcl-2蛋白表达与标本配穴组比较无明显差异(P>0.05)。8.与正常组相比,各组PI3Km RNA表达均有增高明显(P<0.05)。与模型组比,IGF-1组、内关组和标本配穴组PI3Km RNA表达量增加(P<0.01),LY294002组PI3Km RNA表达量低于模型组(P<0.01),标本配穴+LY294002组PI3Km RNA表达量与模型组比较无差异(P>0.05);与标本配穴组相比,IGF-1组PI3K表达量无差异(P>0.05),内关组PI3K表达量低于标本配穴组(P<0.05),LY294002组和标本配穴+LY294002组PI3Km RNA表达量低于标本配穴组(P<0.01)。9.与正常组相比,模型组AKT1m RNA和Akt2m RNA表达升高(P<0.01),LY294002组和标本配穴+LY294002组AKT1m RNA、Akt2m RNA表达明显降低(P<0.01或<0.05),IGF-1组、内关组和标本配穴组AKT1m RNA和Akt2m RNA表达量增加显著(P<0.01)。与模型组比,IGF-1组、内关组和标本配穴组AKT1m RNA和Akt2m RNA表达量增加(P<0.01或<0.05),LY294002组和标本配穴+LY294002组AKT1m RNA、Akt2m RNA表达量低于模型组(P<0.01)。与标本配穴组相比,IGF-1组AKT1m RNA和Akt2m RNA表达量无差异(P>0.05),内关组AKT1m RNA和Akt2m RNA表达量低于标本配穴组(P<0.01或<0.05)。10.与正常组相比,各组PI3K蛋白表达均有增高明显(P<0.05)。与模型组比,IGF-1组、内关组和标本配穴组PI3K蛋白表达量明显增加(P<0.01),LY294002组PI3K蛋白表达量低于模型组(P<0.01),标本配穴+LY294002组PI3K蛋白表达量与模型组比较无差异(P>0.05)。与标本配穴组相比,IGF-1组PI3K蛋白表达量无差异(P>0.05),内关组、LY294002组和标本配穴+LY294002组PI3K蛋白表达低于标本配穴组(P<0.01)。11.对于Akt1和Akt2蛋白来说,LY294002组和标本配穴+LY294002组的Akt1和Akt2蛋白明显低于其它各组,差异有显著性意义(P<0.01);而模型组、IGF-1组、内关组和标本配穴组的Akt1和Akt2蛋白较正常组均升高,差异显著(P<0.01),其中以IGF-1组和标本配穴组升高最为明显。与标本配穴组比,内关组Akt1和Akt2蛋白表达程度降低,差异显著(P<0.01),而IGF-1的Akt1和Akt2蛋白与标本配穴组比无明显差异(P>0.05)。结论:1.“标本配穴”电针治疗能有效改善慢性心肌缺血模型大鼠心率(HR)、ST段电压变化,减轻心肌病理损伤,降低缺血心肌梗死面积,恢复心肌线粒体结构与功能,改善心肌缺血状态,在慢性心肌缺血大鼠治疗中发挥了很好的心肌保护作用。2.“标本配穴”电针治疗可降低心肌细胞凋亡指数,并可调节Caspase3、Caspase9、Bcl-2和Bax等凋亡相关蛋白的表达,上调抗凋亡蛋白表达,抑制促凋亡蛋白表达,在心肌细胞凋亡中起到抑制凋亡的作用,从而保护心肌细胞。3.与单取内关穴治疗相比,“标本配穴”电针治疗在上述各种指标的改善程度上更有优势,提示“标本配穴”有腧穴协同作用,为腧穴配伍效应提供有力证据。4.通过在造模中加入PI3K/Akt通路特异性阻断剂LY294002,导致心肌缺血模型大鼠HR、ST段电压升高明显,HE染色显示心肌病理损伤、心肌线粒体结构破坏、心肌缺血梗死面积比模型组更严重,细胞凋亡指数更高,抑制凋亡的Akt1、Akt2m RNA和PI3K、Bcl-2、Akt1、Akt2蛋白的表达水平下调,促凋亡蛋白Caspase3、Caspase9、Bax蛋白活性表达水平上调;而通过PI3K/Akt通路激活剂IGF-1注射后,上述现象反转,说明细胞内P13K-Akt信号通路参与了“标本配穴”治疗在慢性心肌缺血保护作用中的基因、蛋白调控,但PI3K/Akt是否是心肌缺血保护通路的优势途径,又是否对其它途径产生关联作用,需要在今后的实验研究中进一步验证。