第一部分:结石基因多态性的相关性研究目的:研究含钙结石患者与正常健康者各临床数据间的关系,并对结石相关基因多态性位点进行研究,寻找出尿石症的易感基因和决定疾病易感性的单核昔酸多态性位点,进一步研究尿石症的分子发病机制。方法:釆用病例对照研究的方法,在住院病人中收集502例结石患者,体检中心筛选同结石患者匹配的健康正常受试者500例为对照组,记录各组病人一般情况及临床化验指标。选取全基因组关联研究(GWAS)与肾结石的形成相关的导致尿钙增高的4个基因:TRPV5、CLDN14、KLOTHO及DGKH,通过Hapmap数据库及haploview4.2软件筛选出4个基因的标签SNP的12位点,采用Illumina高通量二代测序方法进行基因分型技术检测尿石症组及对照组的相关基因和其12个位点,通过Hardy-Weinberg(HWE)遗传平衡定律分析各基因型的代表性;分析各基因多态性位点及其与尿路结石发病的风险关联。结果:1.结石组和对照组一般情况比较:在体重指数和血糖两组有明显差异,结石组明显高于对照组(P<0.05),且结石组患者体重为超重(体重指数>24),血糖水平高于正常(6.726.72±1.76>5.9),而对照组体重指数及血糖水平在正常范围.2.TRPV5、CLDN14、KLOTHO及DGKH基因型频率在对照组均符合Hardy-Weinberg(HWE)平衡定律(P>0.05)。(1)对TRPV5基因三个多态性位点的基因型进行分析比较时,我们发现仅rs 4252418多态性位点与尿路结石的发病风险显著相关。与AA纯合子基因型携带者相比,AG杂合子基因型携带者发生尿路结石的OR值为0.010(95%CI=0.007~0.015,P=0.000)。(2)KLOTHO基因三个多态性位点中rs397703多态性位点与尿路结石的发病风险显著相关,与CC纯合子基因型携带者相比,TT纯合子基因型及CT杂合子基因型携带者发生尿路结石的OR值为0.387(95%CI=0.013~0.036,P=0.000)。(3).CLDN14基因型三个多态性位点的基因型进行分析比较时,我们发现rs 219780多态性位点与尿路结石的发病风险显著相关,与GG纯合子基因型携带者相比,AG杂合子基因型携带者发生尿路结石的OR值为0.438(95%CI=0.316,1.832,P=0.045)与尿路结石的发病风险显著相关的多态性位点。(4).DGKH基因型频率三个多态性位点的基因型进行分析比较时,我们未发现与尿路结石的发病风险显著相关的多态性位点。结论:1.临床指标比较,结石组体重指数和血糖明显高于健康对照组;2.TRPV5基因rs4252418多态性位点可能与尿路结石的发病风险显著相关。AA纯合子基因型携带者更易发生尿路结石;3.KLOTHO基因rs397703多态性位点与尿路结石的发病风险显著相关,CC纯合子基因型携带者有较高的发生尿路结石的风险;4.CLDN14基因型rs 219780多态性位点与尿路结石的发病风险显著相关,GG纯合子基因型携带者有较高的尿路结石发生的风险;5.DGKH基因型三个多态性位点未发现与尿路结石发生的相关风险。第二部分:结石相关的基因-基因、基因-环境交互作用研究目的:对影响尿石症的较为重要的社会(环境)因素及基因—基因之间关系进行探讨,分析基因—基因、基因—环境的交互作用,探讨基因和环境因素在尿石症发病中的相互作用。以期发现能够显著增加疾病的发病风险的基因、环境因素的组合形式。方法:通过对以往文献检索找出影响尿石症发生的社会(环境)影响因素,对病例和对照进行问卷调查收集数据,采用叉生分析分析基因—基因、基因—环境的交互作用,分析探讨基因与基因和基因与环境因素在尿石症发病中的相互作用。结果:1.TRPV5-Rs4252418和CLDN14-Rs219780的交互作用具有统计学意义(P<0.05):(1)TRPV5-Rs4252418和CLDN14-Rs219780的交互作用S=1.19,说明两者有正交互作用,即TRPV5和CLDN14在尿路结石发生上有相互增加的风险。AP=0.23,表明两基因等位基因均突变时相对于尿路结石的发生有23%的风险是两基因交互作用。RERI=0.20表明由于两基因的交互作用发生尿路结石风险是未知原因(OR=1)的0.20倍(P<0.05)。(2).TRPV5-Rs4252418和KLOTHO-Rs397703的交互作用S=1.56,说明两者有正交互作用,即TRPV5和KLOTHO在尿路结石发生上有相互增加的风险。AP=0.03,表明两基因等位基因均突变时相对于尿路结石的发生有3%的风险是两基因交互作用。RERI=0.12表明由于两基因的交互作用发生尿路结石风险是未知原因(OR=1)的0.12倍(P<0.05)。2.TRPV5、CLDN14和KLOTHO与环境因素饮水量通过叉生分析进行模型统计检验后,基于相加模型的交互作用未发现有统计学意义,但基于相乘模型的交互作用有一个统计学意义(ORint=0.65,P’=0.002);TRPV5-Rs4252418和饮水量交互作用时OR>1,说明两者有正交互作用,表明两者均突变时可增加尿路结石发生的风险。结论:1.TRPV5-Rs4252418和CLDN14-Rs219780尿路结石发生上两者有正交互作用;2.TRPV5-Rs4252418和KLOTHO-Rs397703相互作用有增加尿路结石发生的风险;3.TRPV5-Rs4252418和饮水量交互作用时有正交互作用,两者均突变时可增加尿路结石发生的风险。第三部分:TRPV5在含钙结石肾脏及正常肾脏中的表达目的:比较细胞膜钙离子通道TRPV5在含钙肾结石患者和正常无结石者肾脏中表达的差异,探讨TRPV5在含钙肾结石形成中的作用机制,方法:选取我院2017年前手术患者中含钙结石组及正常对照组各5例,结石组病例均经24H尿液分析结果尿钙水平高于正常(男性>300mg/24h、女性>250 mg/24h)的因结石导致手术切除的肾脏或经PCNL术毕退鞘时取少量肾皮质组织,且术后常规结石成分分析证实为含钙结石的患者5例,其中男性3例,女性2例,平均年龄55.6±16.21岁,肾铸型结石1例,多发性结石4例。正常对照组5例为尿钙均正常的肾癌患者,男性2例,女性3例,平均年龄53.2±14.37岁,取组织结构正常的肾脏皮质,5例患者术前均经B超和CT等影像检查均无结石,术中术后也未发现结石,无肾脏萎缩等其他因素影响。通过免疫组化及Western-blot比较TRPV5在含钙肾结石患者和正常无结石者肾脏中表达的差异。结果:分别对两组肾组织进行免疫组化及Western-blot检查,采用Image-pro plus 6.0及ImageJ图像分析软件对图片进行分析,t检验结果显示含钙结石组肾组织的TRPV5蛋白表达水平在免疫组化及Western-blot检查中均明显低于其在正常组肾组织中的表达水平,免疫组化(平均光密度:t=4.198,p=0.001,P<0.01;平均累计光密度:t=2.963,p=0.013);Western-blot(灰度值:t=4.951,p=0.008,P<0.01)。结论:在含钙肾结石组患者肾组织的TRPV5蛋白表达水平明显低于其在正常组肾组织中的表达水平。