角膜病患病率高，致盲性强，居世界致盲原因的第二位。角膜盲最有效的治疗方法是角膜移植术，但因来源不足、免疫排斥、移植并发症等原因急需寻找替代材料。异种角膜脱细胞支架材料不仅保留了与天然角膜组织相似的基质层胶原结构，而且可能还存留一定的细胞因子成分，能促进细胞移植、生长和组织重建，因此在角膜组织工程中有着天然的优势。但不同的脱细胞方法对角膜基质的结构和成分影响较大，开发一种可以高效低毒去除组织中细胞成分等的工艺流程对于角膜组织工程支架的制备十分重要。
　　Myroilysin是深海产蛋白菌株Myroides profundi D25分泌的M12家族的弹性蛋白酶，实验中发现myroilysin有去除组织中细胞成分的功能。本研究首先通过筛选保护剂提高了myroilysin在溶液中的稳定性，延长了保存时间，然后利用myroilysin建立了高效低毒制备猪角膜脱细胞支架的流程方法，并对支架进行了形态学和组织学检测，分析其物理化学性质。最后，本研究对新西兰兔角膜板层缺损模型进行了支架移植手术，并通过术后新西兰兔角膜植片的恢复，评估了猪角膜脱细胞支架的应用潜力。
　　1.海洋细菌蛋白酶myroilysin稳定性的提升和稳定剂的筛选
　　首先检测了4种保护因子:葡萄糖、海藻糖、蔗糖和甘油在不同浓度下对myroilysin稳定性的影响，并将4种保护剂按照不同浓度设计了9种组合保护剂的配方。筛选到了保护myroilysin酶活性的最佳配方:在37℃下保存1d后，不添加保护剂的myroilysin酶活性降至5％以下，在该配方保护剂中酶活性基本没有降低，5d后酶活性约为90％。
　　2.海洋细菌蛋白酶myroilysin制备猪角膜脱细胞支架的方法建立及支架性能的检测
　　通过应用新型海洋蛋白酶myroilysin，建立了一种制备猪角膜脱细胞支架的流程方法。应用myroilysin制备的猪角膜脱细胞支架，脱水后保持着极高的透明度，基质中不仅没有细胞及DNA残余成分，而且通过扫描电镜观察到其微观胶原纤维结构保存完好，并形成了一定的孔隙结构。在人角膜基质细胞的毒性实验中，myroilysin制备的猪角膜脱细胞支架呈现了较好的细胞相容性。通过胶原酶降解实验，检测到猪角膜脱细胞支架的稳定性略差于天然猪角膜。
　　3.猪角膜脱细胞支架在体内角膜重建中的应用潜力研究
　　以胶原成分为主的猪角膜脱细胞支架的机械强度较差，为了增加其机械强度，对猪角膜脱细胞支架进行了核黄素交联处理。在建立新西兰兔角膜板层缺损模型的基础上，进行了角膜脱细胞支架（植片）的板层移植。移植后，在裂隙灯下观察到植片没有引起新西兰兔强烈的炎症反应。兔角膜上皮细胞在术后一个月覆盖了植片表面，表明植片有良好的组织相容性。植片移植后三个月，与受体组织融合良好，其透明度、曲率及生物力学性质与天然兔角膜相近。进一步通过组织化学方法观察了移植后的组织相容性和组织重建过程。
　　综上所述，Myroilysin是一种较好的角膜组织脱细胞制剂。制备过程条件温和、简单、成本低、效率高、毒性低。制备的支架保存了角膜固有的组织层次和生理生化特性，并成功地用于新西兰兔的角膜重建，为组织工程角膜的体内重建奠定了基础。