目的:在建立穿心莲离体快繁的基础上,采用秋水仙碱诱导穿心莲的多种实验材料,建立多倍体的鉴定的方案,筛选出穿心莲同源四倍体的诱导方案,并通过实时荧光定量PCR的分析方法研究两种不同倍性的穿心莲中,控制穿心莲内酯合成的关键的限制性内切酶的ApCPS基因的相对表达量,探讨穿心莲倍性水平的变化对穿心莲内酯类成分表达的影响,以期为穿心莲优良株系选育及种质创新研究提供实验基础。方法:1.穿心莲成熟胚离体快繁体系的建立。采用植物组织离体培养技术,以穿心莲的成熟胚为实验材料,建立穿心莲成熟胚离体快繁殖体系,为后期多倍体诱导实验提供实验材料。2.多倍体诱导方法的筛选。选用秋水仙碱为化学诱导剂,在穿心莲成熟胚离体快繁体系建立的基础上,以穿心莲的种子、经过催芽处理的穿心莲的种子、刚萌发的成熟胚、秋水仙碱加入丛芽诱导的培养基诱导丛芽等四种诱导方式,考察诱导材料的选择、诱导剂的浓度、诱导处理时间的选择等三个因素对实验材料存活率、诱导率、实验材料生长状况的影响。3.多倍体鉴定方案的建立。以未经过诱导处理的实验材料为空白对照组,以叶片形态的变异特征和气孔特征变异特征的材料作为倍性变化的初步筛选,通过在光学显微镜下观察保卫细胞的形态特征(气孔的大小、密度)进行初步筛选,对于存在气孔特征变异的材料进行根尖染色体数目的鉴定,并以流式细胞仪进行倍性水平的鉴定。4.不同处理组实验材料形态学的初步比较研究。由于秋水仙碱的双重作用,秋水仙碱可以引起不同处理组的实验材料生长形态的发生变化,主要观察实验材料的生长锥、胚轴、叶片厚度、气孔特征、茎的横切面等特征的变化,研究秋水仙碱对每种材料的有效诱导浓度及毒性作用表现。5.两种倍性的穿心莲ApCPS基因的相对表达量分析。分别取同源四倍体的无菌苗和二倍体对照组无菌苗,取不同生长期的叶片为实验材料,以ApCPS为目的基因,以UBS为内参引物,检测目的基因的相对表达量。结果:1.穿心莲离体快繁体系建立。在穿心莲成熟胚离体快繁体系的建立中,以200 mg/L的GA3浸泡穿心莲的成熟胚48 h,灭菌体系为75%的EtOH(45 s)+ HgCb(8 min),以1/2MS为基础培养基,以0.1 mg/L 6-BA+0.1mg/LN AN为最佳丛芽诱导的条件,1/2 MS培养基中的蔗糖含量为20 g/L、NAA含量为0.1 mg/L时有利于组培苗的壮苗生根,以河沙:蛭石-=1:1为最佳炼苗基质。2.多倍体鉴定方案的建立。鉴定方案为,以叶片形态特征结合气孔特征进行初步筛选,并以流式细胞仪进行倍性水平的确定。由于二倍体穿心莲(2n = 2X= 50)染色体数目为50,其同源四倍体(2n = 4X= 100)对应的染色体数目为100,染色体数目较多,因而不利于在显微镜下计数,且根尖染色体数目计数操作步骤较为繁琐,故未选用此种方法进行植物倍性水平的鉴定。3.多倍体诱导的结果。穿心莲同源四倍体的诱导方案为:用200 mg/L的GA3浸泡穿心莲的成熟胚24 h后,接种于1/2 MS培养基中培养11 d-14d后,选取已萌发出一对子叶的成熟胚,置于0.05%、0.075%的秋水仙碱溶液中浸泡24 h,再接种于新的1/2 MS培养基继续培养继续培养,经过流式细胞仪检测,获得4株穿心莲穿心莲同源四倍体的无菌苗。另外,(1)以秋水仙碱直接诱导穿心莲的种子没有获得四倍体材料,在0.1%的秋水仙碱处理72 h,0.2%的秋水仙碱处理48 h、72 h,0.4%的秋水仙碱处理48 h,得变异的无菌苗为嵌合体,0.4%的秋水仙碱诱导72 h获得5株含八倍体保卫细胞组成的气孔的嵌合体,而诱导处理时间少于24 h的处理组没有得到存在形态差异的无菌苗。(2)在以秋水仙碱直接诱导GA3处理过的种子,未获得纯合的四倍体无菌苗,在0.4%的秋水仙碱48 h的处理子获得2株八倍体保卫细胞组成的气孔的嵌合体(3)在以丛生芽为诱导材料的实验中,由于秋水仙碱对用于丛芽诱导的材料的毒性作用,导致即使在较低浓度的秋水仙碱诱导处理情况下,茎尖全部死亡,不利于实验的继续进行,因而弃用茎尖作为诱导实验材料。4.秋水仙碱对诱导材料生长的影响。(1)形态学特征。存在变异的无菌苗与未经过秋水仙碱处理的材料相比,叶片较厚,颜色深,同时叶片褶皱明显。存在气孔特征变异的无菌苗,其气孔特征,包括气孔的大小、气孔的密度、气孔中所含叶绿体的数目均存在显著性差异(p<0.01)。(2)毒性表现。高浓度的秋水仙碱对以种子为诱导材料的影响主要表现在对胚根的毒性作用,引起胚根的褐化甚至坏死而导致种子的死亡;高浓度的秋水仙碱对刚萌发的成熟胚的毒性作用主要表现在生长锥的毒性作用,引起生长锥膨大,甚至死亡。另外,秋水仙碱对茎的形态的作用,会引起皮层细胞宽,导致茎的畸形。5.两种倍性无菌苗ApCPS基因相对表达量的结果分析。选用生长56 d与84 d的四倍体、未经诱导处理的二倍体无菌苗。在生长期56 d两组材料中,二倍体材料的ApCPS基因表达量高于四倍体材料,在生长期为84 d的两种倍性的材料中,四倍体材料的ApCPS基因表达量高于二倍体材料(P<0.05)。结论:1.以1/2MS为基础培养基,采用1/2MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA为丛芽诱导,1/2 MS+NAA0.1 mg/L壮苗生根诱导;以河沙:蛭石(1:1)为炼苗基质的穿心莲离体快繁体系可获得增殖频率较高的穿心莲组培苗,为穿心莲种质倍性育种实验奠定了基础。2.以秋水仙碱为诱导剂对穿心莲幼胚的多倍体诱导研究,获得到4株的穿心莲同源四倍体无菌苗,编号分别为Ap1-1、Ap1-2、Ap1-3、Ap1-4。3.经过诱导变异的无菌苗,在植株物形态特征上,叶片颜色、叶片的厚度、茎的形态、气孔特征等方面均存在一定的差异。通过诱导材料的叶片气孔特征集合流式细胞仪法鉴定方案组合,可快速、准确地对诱变材料的倍性水平进行鉴别。4.通过检测两种不同倍性不同生长期的穿心莲叶片的ApCPS基因的相对表达量,研究结果表明同一生长期不同倍性的穿心莲的穿心莲内酯类化合物的代谢存在差异。本研究在穿心莲成熟胚离体快繁的基础上,获得了 4株的穿心莲同源四倍体无菌苗,建立了秋水仙碱诱导穿心莲同源四倍体的方案与鉴定方案,从分子水平研究了不同倍性不同生长期的穿心莲中ApCPS基因的相对表达量,为穿心莲的种苗复壮和种质创新研究提供了实验依据,为穿心莲多倍体育种的研究奠定了的基础。