错配修复(mismatch repair，MMR)是DNA修复路径中最重要的途径之一，在细胞生命活动过程中对维持基因组稳定性起到非常重要的作用,DNAMMR功能缺陷会诱发癌变。因而对各种细胞在不同生理和病理条件下DNA MMR活性进行分析具有重要意义。　　2004年美国德州大学孙鲁浙教授所领导的团队在世界上首次提出以绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因对活细胞内DNA MMR活性进行分析的模型，并证实了其可行性。但该模型中所构建的EGFP异源底物存在不依赖于DNAMMR的非特异性表达，因而削弱了该模型检测的精度和灵敏度。本实验室在原有模型的基础上，经过一系列的改良与摸索，探索出了一套全新制备单链以及EGFP异源底物的方法，该法很好的消除了原模型中潜在的EGFP背景值,简化了实验流程，对原有模型的成熟和完善起到了很大的推动作用。本课题是基于实验室前期研究的基础上，为了进一步完善DNA MMR活性分析模型并将其应用于毒理学而提出的，它旨在解决DNA MMR活性检测模型中作为参照标准红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白表达不同一的问题。拟通过双顺反子载体使EGFP和RFP位于同一基因链上，使表达同一化，从而解决原有模型中分别转染两种荧光质粒所产生的红绿荧光表达不同一的问题.　　首先，在原有DNA MMR活性分析模型的基础上，我们使用EGFP表达正常型的质粒pGEM5Z(+)-EGFP(p111)和EGFP突变型不能正常表达绿色荧光蛋白的质粒pGEM5Z(+)-(m)EGFP(p189)为模板，设计特异引物，扩增出模板上EGFP片段，然后酶连入双顺反子真核表达载体pIRES2-Dsred2中。成功获得了正常型的双色荧光表达质粒pEGFP-IRES2-Dsred2(p197)和缺失型的双色荧光表达质粒p(m)EGFP-IRES2-Dsred2(p198)，经酶切分析、测序以及细胞表达效果鉴定，p197能够同时表达红色和绿色荧光两种蛋白，p198只能表达红色荧光蛋白，绿色荧光蛋白的表达缺失。测序与野生型EGFP序列比对结果显示，质粒p198中EGFP基因与p189中对应序列无差别;质粒p197中EGFP基因序列与p111中对应序列也无差别，因而两种质粒可以很好的用于下步G-T错配异源底物的构建。　　其次，以第一部分构建的双色荧光质粒p197为材料，采用我们先前建立的体外制备单链DNA的办法，利用新型缺刻酶Nb.BsrdⅠ和外源核酸酶ExonucleaseⅢ处理p197，我们获取了高纯度的ssDNA分子。我们将所获得的p197编码股高纯度单链DNA与AseⅠ线性化的p197以及p198进行退火，对产物运用plasmid-safe ATP dependent DNase的新型纯化方法处理，高效的制备了优质的同、异源双链分子，将所获得的同、异源双链分子转染进一株DNA MMR功能正常的细胞Hela和一株DNA MMR功能缺陷的细胞株HCT116中，对EGFP的表达情况运用显微镜和流式细胞仪进行分析，统计结果显示两种细胞株的DNA MMR活性存在明显的差别(P≤0.05)，初步显示了双色荧光质粒应用于DNAMMR活性分析上的价值。　　最后针对于构建的双色异源底物中潜在SV40启动子启动的EGFP非特异表达以及在单链DNA制备上的局限性，我们利用p111和p189为载体，以pIRES2-Dsred2为模板，PCR扩增出IRES2-Dsred2片段，将其连入载体p111和p189EGFP基因下游，成功获得了另一对双色荧光重组质粒p199和p200，经酶切和细胞转染效果鉴定，均与预期一致。新双色荧光质粒的成功构建为解决原双色异源底物中潜在的问题创造了条件，也为本课题的后续研究打下了基础。