背景:缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)是同种异体肾移植功能延迟的常见原因之一,并且与移植后长期肾功能不良有关。在肾移植以及其他手术过程中,如肾结石手术,肾肿瘤的实质保留手术和肾动脉手术等,会发生完全和长时间的肾动脉血流中断。而长期肾缺血是导致急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)的主要原因。缺血和再灌注期间发生各种生物化学变化,包括活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)释放、细胞凋亡、坏死、炎症细胞浸润和炎性介质释放,这可导致肾组织损伤。由于肾IRI的病理生理过程复杂,且具有高发病率和死亡率的特点,因此研究者积极寻找新的治疗策略来降低急性死亡率和预防AKI进展为慢性肾衰竭。内质网(Endoplamic Reticulum,ER)是细胞内关键的细胞器,负责细胞膜和分泌蛋白的合成和折叠,还可以作为Ca2+储存器。由于不利的局部环境异常,例如Ca2+稳态破坏、缺氧、病毒或细菌感染,均可以干扰蛋白质的正常折叠,导致未折叠蛋白的蓄积,诱发内质网应激(Endoplamic Reticulum Stress,ERS)。在ERS的情况下,未折叠蛋白在ER蓄积是物种进化上高度保守的细胞自适应的结果,称为未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)。哺乳动物细胞的ER有三个关键的跨膜蛋白感受器参与UPR,包括转录活化因子 6(Activating Transcription Factor 6,ATF6)、肌醇需要酶 1(Inositol-Requiring Enzyme 1α,IRE1α)、蛋白激酶样内质网激酶(PKRP-likeERKinase,PERK)。在静息状态下,上述三个感受器与葡萄糖调节蛋白78(Glucose Regulated Protein78,GRP78)/免疫球蛋白结合蛋白(Binding Immunoglobulin Protein,BiP)结合而失去活性。当ER中错误折叠蛋白积累,BiP与感受器解离,与未折叠蛋白结合而激活,产生PERK/eIF2α、IRE1α/XBP1s和ATF6/ERSE三条主要的信号通路。随后,ATF6移动到高尔基体,并被S1和S2蛋白酶切割,具有DNA结合域的胞质裂解片段(ATF6n)迁移到细胞核内,激活编码ER分子伴侣蛋白,促进蛋白质折叠、成熟、分泌及ER相关降解(ER-associated degradation,ERAD)等基因的转录。GRP78表达上调是证实UPR发生的标志蛋白。由此可见,UPR可以维持ER功能,有利于细胞从应激中恢复,并可对额外应激提供“适应性”反应。然而,持续或延长的ERS是有害的,可以导致细胞凋亡。细胞凋亡被认为是肾IRI期间细胞死亡的主要形式,甚至可以独立于炎症并影响器官的功能。缺血可诱导肾小管任何节段的细胞凋亡。细胞凋亡的途径包括PERK,C/EBP同源蛋白(C/EBP Homologous Protein-10,CHOP)的诱导,以及IRE1a激酶/RNase活化。后者可导致肿瘤坏死因子受体相关因子2(Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor 2,TRAF2)活化,细胞凋亡信号调节激酶 1(Apoptosis Signal-regulating Kinase 1,ASK1)和c-Jun氨基末端激酶(JunN-terminal Kinase,JNK)的激活。大量的研究已证实,ERS是缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)诱导的AKI的机制之一。I/R损伤诱导肾脏的ERS,包括诱导XBP1剪接及GRP78上调,主要发生在近曲小管上皮细胞。其中IRE1α/XBP1是ERS发生十分重要的一条信号通路,主要参与脂质合成,ERAD,蛋白质的折叠、转运和分泌。IRE1a在正常情况下保持无活性状态;当ERS状态下,IRE1发生二聚化,进而发生自身磷酸化被激活。IRE1是XBP1的上游调节子,介导pre-XBP1mRNA的剪接。XBP1具有XBP1s和XBP1u两种形式。研究表明,只有剪接形式的XBP1(XBP1s)可以诱导有效的UPR。有数据表明,脓毒血症诱导ERS的发生,激活IRE1-NF-κB通路,通过近端肾小管上皮细胞促炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)产物的增加来加速脓毒血症AKI的发生。由此可见,ERS可以激活NF-κB。NF-κB是TNF-α,IL-1β和IL-6等炎症因子的关键转录调节子。大量的证据表明,NF-κB的激活可以导致促炎症因子基因的转录,触发炎症级联反应,在肾IRI中起到关键作用。一些研究已经确定,某些小分子抑制剂可选择性地阻断IRE1/XBP1的激活,从而减轻ERS导致的组织损伤。IRE1有两个主要位点已被确定作为开发抑制剂的靶向目标:核糖核酸酶结构域的催化核心和激酶结构域的ATP结合位点。靶向核糖核酸酶结构域的小分子物质包括:水杨酸醛、4 μ8C、MKC-946、STF803010等。STF083010是一种新的IRE1/XBP1抑制剂,通过抑制IRE1α的核糖核酸酶活性来抑制XBP1mRNA剪接,而不影响IRE1α的磷酸化过程,从而降低XBP1s蛋白水平,具有潜在的抑制长时间ERS的作用,防止细胞的进一步损伤。研究证实,STF83010具有显著的抗骨髓瘤,重建乳腺癌MCF7-TAMR细胞对他莫昔芬治疗的敏感性以及减少创伤后应激大鼠蓝斑部位神经细胞凋亡作用。因此,我们将XBP1抑制剂STF083010应用于肾IRI,观察其对肾IRI的作用,并初步探讨其可能的机制。目的:探讨XBP1抑制剂STF083010在肾缺血再灌注损伤过程中的作用及可能机制。方法:雄性SD(Sprague Dawley)大鼠24只,体重(150-200)克,随机分为假手术组(Sham),缺血再灌注组(Model),STF083010组,Mock组,每组6只大鼠。Sham组:大鼠开腹后,仅分离双侧肾动脉而不夹闭。Model组:大鼠开腹后,分离双侧肾动脉,无创血管夹同时夹闭肾动脉40分钟后放开血管夹进行再灌注。STF083010组:应用DMSO将STF083010试剂进行完全溶解后,使用生理盐水稀释为浓度3毫克/毫升,术前1小时按照15毫克/公斤的剂量进行腹腔注射。Mock组:术前1小时按照0.5毫升DMSO的剂量进行腹腔注射。各组SD大鼠以再灌注开始时间为标准,24h后处死大鼠,应用留置针于腹主动脉采血4毫升放入促凝管中,以3000转/分钟离心20分钟后,留取血清-80 ℃低温冰箱冻存。立即用0.9%氯化钠注射液通过腹主动脉冲洗双肾,直至双肾颜色由红变白,摘下两肾分块处理后-80 ℃低温冰箱冻存备用。第一部分:观察各组大鼠肾组织形态和生化指标的变化。各组HE染色,血清肌酐(Serum Creatinine,Scr)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)检测。第二部分:观察STF083010对肾IRI炎症途径的影响。检测各组肾组织髓过氧化物酶(MPO)活性;ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β的水平;免疫组化检测肾组织XBP1s、NF-κBp65蛋白情况;RT-PCR检测肾组织XBP1s、XBP1u的mRNA 表达量情况;Western blot 检测肾组织 XBP1s、GRP78、pIRE1、NF-κBp65蛋白的表达情况。第三部分:观察STF083010对肾IRI凋亡途径的影响。TUNEL法检测各组肾组织细胞凋亡情况;免疫组化检测肾组织CHOP蛋白情况;Western blot检测肾组织CHOP和cleaved Caspase 3蛋白的表达情况。结果:1.本研究显示:大鼠 Model 组 Scr(136.48±28.70)umol/l 和 BUN(38.59±7.79)mmol/l,较 Sham 组 Scr(61.48±11.67)umol/1 和 BUN(7.88±2.30)mmol/1 明显升高,差异有显著性(p<0.05)。Model组大体标本可见肾脏体积增大,髓质淤血,颜色晦暗,皮质颜色较苍白。HE染色光镜下可见肾小球损伤轻微,主要以肾小管损伤为主,肾小管上皮细胞肿胀,水样变性,出现不同程度坏死,脱落细胞较多,可见管型;间质有充血、水肿及炎细胞浸润。Model组肾小管坏死评分明显升高,与Sham组比较差异有统计学意义(p<0.05)。从生化和病理形态学上证实缺血再灌注模型成功建立。2.大鼠肾I/R造模前应用STF083010处理后发现:STF083010组Scr(78.97±14.35)umol/l 和 BUN(17.45±3.72)mmol/l,显著低于 Model 组 Scr(136.48 ±28.70)umol/1 和 BUN(38.59±7.79)mmol/l(p<0.05)。光镜下 STF083010 组与 Model组相比,肾小管上皮细胞肿胀明显减轻,偶见小管上皮细胞坏死及细胞脱落,间质水肿及炎细胞浸润减轻。肾小管坏死评分明显降低(p<0.05)。证明了STF083010可以减轻肾脏功能损伤及改善肾组织形态损伤。3.免疫组化显示:Model组的NF-κB p65及XBP1s主要分布在皮髓质交界区,尤其是近端肾小管的区域。ELISA结果显示:与Sham组相比,Model组血清TNF-α、IL-1β的水平明显升高(p<0.05)。MPO活力结果显示:与Sham组相比,Model组MPO活力明显升高(p<0.05)。RT-PCR结果显示:Model组XBP1s mRNA水平显著升高,XBP1s/XBP1u mRNA比值8.69,较Sham组增加了 7.69倍。Western blot结果显示:Model组XBP1s、pIRE1、GRP78和NF-κB p65(细胞核内)蛋白表达水平较Sham组明显升高,差异具有显著性(p<0.05)。这说明,I/R损伤后炎症介质升高,诱发了 ERS,启动了 UPR。IRI时,细胞浆内NF-κB p65蛋白表达水平降低,而细胞核内NF-κBp65蛋白表达水平升高。证实了 I/R损伤导致NF-κB p65活化。大鼠肾I/R造模前应用STF083010处理后发现:与Model组相比,STF083010组XBP1s及NF-κB p65在皮髓质交界区的表达显著降低(p<0.05)。血清TNF-α、IL-1β的水平明显降低(p<0.05)。MPO活力明显降低(p<0.05)。STF083010 组 XBP1s/XBP1u mRNA 比值降低,两者之比 2.74。XBP1s、pIRE1、GRP78和NF-κB p65(细胞核内)蛋白表达水平明显降低(p<0.05)。证实了 STF083010可以通过抑制ERS减轻肾I/R诱导的炎症反应。4.与Sham组相比,Model组凋亡指数明显升高,凋亡主要集中在近曲小管上皮细胞和远曲小管上皮细胞;而STF083010组凋亡指数明显降低(p<0.05)。因此,证实了肾I/R导致细胞凋亡,且STF083010具有减少细胞凋亡的作用。免疫组化显示:与Sham组相比,Model组CHOP表达水平明显增加,主要分布在皮质区的肾小管上皮细胞。STF083010组CHOP表达水平较Model组明显降低(p<0.05)。Western blot 显示:STF083010 组 CHOP 和 cleaved Caspase 3 蛋白表达水平较Model组明显降低(p<0.05),与TUNEL结果符合。以上提示,STF083010具有改善肾I/R导致细胞凋亡的作用。结论:1.STF083010可以改善缺血再灌注SD大鼠的肾功能,减轻肾小管上皮细胞肿胀、间质水肿及炎细胞浸润减轻;肾小管坏死评分明显降低。证实STF083010对肾IRI具有保护作用。2.大鼠肾IRI时,XBP1s、GRP78、pIRE1水平增加,我们推测I/R激活了ERS,启动了 UPR。3.STF083010可以使XBP1s/XBP1u mRNA比值降低,pIRE1蛋白表达降低,推测其通过阻断IRE1所诱导的XBP1的剪接,从而降低XBP1s的水平,炎症因子NF-κB、TNF-a、IL-1β的表达减少,从而发挥其抗炎效应。STF083010对大鼠肾IRI的保护作用与其抗炎机制有关。4.STF083010可能通过阻断IRE1所诱导的XBP1的剪接,抑制了促凋亡因子CHOP和cleaved Caspase 3相关的细胞凋亡,从而发挥其抗凋亡效应。STF083010对大鼠肾IRI的保护作用与其抗凋亡机制有关。