菊花(Chrysanthemum morifolium)作为中国十大传统名花和世界四大切花之一,受到世界各地人们的喜爱。目前市场上切花菊花期主要在秋季,存在花期相对集中的缺陷。‘优香’是从日本引进的典型夏菊品种,花期在6-9月,其花型饱满、花色纯正、抗性强等品质受到很多切花菊公司的青睐。对于菊花开花分子机制的研究,可以为菊花生产及花期调控提供有利的理论依据。BBX蛋白属于一个功能多样的家族,一方面参与生长发育调控,另一方面也能够响应非生物胁迫信号。迄今为止,在模式植物中参与开花调控已经有很多的报道,然而在菊花中的进展还是比较的少。本研究的实验材料为夏菊’优香’,高保真验证得到夏菊’优香’CmBBX13和CmBBX15全长序列,利用生物信息学软件进行序列分析,用实时荧光定量PCR、酵母双杂、亚细胞定位等方法分析CmBBX13和CmBBX15转录因子的表达模式,最后利用转基因技术,初步探究夏菊’优香’CmBBX13在花期调控方面的作用机制。本文的结论和结果如下:1.根据菊花‘优香’转录组数据,并通过高保真全长验证克隆得到三个BBX家族基與序列。通过进化树分析,将与拟南芥的AtBBK13同源性较高的基因命名为CmBBX13;另外两个都与AtBBX15同源性较高,将长日照条件下显著差异表达基因命名为CmBBX15.1,短日照条件下显著差异表达基因则命名为CmBBX15.2。2.利用荧光定量分析了这三个基因的组织特异性、长短日照节律钟表达模式,以及在三种胁迫处理下的表达变化。CmBBX13主要在叶和茎尖中表达量最高,而CmBBX15.1和CmBBX15.2的表达量都是在叶中最高,根中最低。在长短日照条件下,CmBBX13的表达模式并没有节律性;而CmBBX15.1只在长日照条件下有显著表达,CmBBX15.2虽然在长短日均有表达,但节律性主要出现在短日条件下。此外,在低温、干旱及盐三种非生物胁迫处理下,响应时间和表达幅度都有较大的差异,可能因为这三个基因对不同胁迫处理下的响应机制不同,但其参与非生物胁迫信号路径的机制有待进一步研究。3.亚细胞定位分析显示CmBBX13、CmBBX15.1和CmBBX15.2蛋白都定位在细胞核上。酵母单杂实验表明,CmBBX13没有转录激活活性,另外两个基因CmBBX15.1和CmBBX15.2都有转录激活活性,且激活域位于B-Box和CCT保守结构域之间。4.构建植物表达载体pDEST-35AA-SRDX-CmBBX13(含终止密码子)、pMDC43-CmBBX15.1、pDEST-SRDX-CmBBX15.1、pMDC43-CmBBX15.2、pDEST-SRDX-CmBBX15.2,通过抗性和半定量筛选,获得了拟南芥转基因株系。研究结果发现,CmBBX13超表达转基因拟南芥在长日照条件下的莲座叶比野生型多,并且花期推迟5天左右。进一步对拟南芥开花相关基因定量分析发现转基因株系中相关开花促进基因如API、SOC1、FUL、IFY、FT、FD、CO表达降低,而开花抑制基因FLC、TOE2、FRI表达上升。CmBBX15.1和CmBBX15.2的转基因株系与野生型的花期基本一致,推测对花期无直接影响。另外通过对突变体的表型观察,发现拟南芥AtBBX13突变体bbx13能使花期提前。