人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的艾滋病对人类的健康构成严重的威胁，艾滋病的治疗不容乐观，药物治疗只能抑制病毒复制，不能杀灭病毒，更无法阻止其蔓延，还未能找到一个完全有效的疫苗，目前已经进入临床试验的HIV疫苗都不能产生广谱的中和抗体。研究人员发现个别HIV感染者长期不发病或有自愈的情况，科研人员从天然病毒抑制者或长期不发展者的外周血单个核细胞(PBMC)中分离人单克隆抗体基因，这些广谱中和抗体能够中和HIV的很多不同的毒株，目前发表的抗HIV广谱中和抗体有2G12、b12、17b、2F5、4E10、PG9、PG16、VRCO1和VRCO2等，其中VRCO1和VRCO2能够中和90％以上已知的HIV毒株，而且2G12、b12、2F5和4E10已应用在人体试验中，安全无毒副作用，而且可延缓病毒载量的反弹。　　HIV广谱中和抗体在治疗艾滋病方面，由于哺乳细胞表达中和抗体成本高、技术难度大，在体内半衰期短、需多次用药等缺点很难广泛应用于艾滋病的治疗和预防。我国表达载体和细胞株改造都远远落后于欧美国家，所以治疗性抗体药物重点解决的问题之一是建立高效表达抗体基因的载体。将中和抗体基因构建于AAV、DNA、Adv及慢病毒等载体中，这些载体在体内进行长期高效地表达中和抗体的基因治疗就显得尤为重要。　　本研究的目的是建立高效表达HIV中和抗体的AAV载体、DNA载体、Adv载体和慢病毒载体平台，利用已经建立的表达HIV中和抗体的四种载体平台，分别表达了不同类型的HIV-1保护性抗体，包括HIV-1 gp120 CD4结合位点(CD4bs)中和抗体（N12-B2）、CD4诱导(CD4i)中和抗体(N12-I2、N12-I15)和其它类型的中和抗体(N12-O2)，表达这些中和抗体的目的不仅验证所建立的平台也可用于国内HIV感染者的治疗。　　为建立高效表达HIV中和抗体的AAV载体、DNA载体、Adv载体和慢病毒载体平台，利用已发表的HIV中和抗体2G12作为模型，将其轻、重链全基因分别构建到质粒DNA载体、AAV载体、Adv载体及慢病毒载体上进行表达，通过多种表达双基因的构建策略比较2G12的表达效果，最终针对四种表达载体分别筛选获得一种最佳高效表达人抗体2G12的构建方案。在建立AAV载体表达中和抗体基因平台的研究中，采用了14种双基因构建方案，分别转染293T细胞或BHK-21细胞，采用ELISA方法检测2G12的表达量和结合活性，通过HIV假病毒中和实验检测其中和活性，将表达效果最好方案的质粒包装AAV，检测其病毒感染能力，并在SCID小鼠体内进行了长期的表达，检测小鼠血清中2G12的中和活性;在建立DNA载体表达中和抗体基因平台的研究中，采用了10种双基因构建方案，分别瞬时转染293T细胞，采用ELISA方法检测2G12的表达量和结合活性，纯化后检测其中和活性，并检测其在SCID小鼠体内的表达;在建立慢病毒载体表达中和抗体基因平台的研究中，使用两种慢病毒表达系统，通过比较使用其中一个表达系统，在此系统中采用了5种双基因构建方案，分别转染293T细胞，采用ELISA方法检测2G12的表达量和结合活性，纯化后检测其中和活性。将表达效果最好方案的质粒包装慢病毒，检测其病毒滴度和感染能力，并将慢病毒浓缩纯化后免疫SCID小鼠检测其在动物体内的表达;在建立Adv载体表达中和抗体基因平台的研究中，采用了6种双基因构建方案，分别转染293T细胞，采用ELISA方法检测2G12的表达量和结合活性，纯化后检测其中和活性。将表达效果最好方案的质粒包装Adv，检测其病毒滴度和感染能力，并检测其在SCID小鼠体内的表达。　　利用已建立的表达HIV中和抗体的AAV载体、DNA载体、Adv载体和慢病毒载体平台，分别表达国际合作单位马里兰大学人类病毒学研究所筛选到的保护性抗体N12-B2、N12-I2、N12-I15、N12-O2的全基因，分别检测其结合活性和中和活性，在SCID小鼠体内检测部分抗体的表达效果。　　通过实验研究，在建立AAV载体表达中和抗体基因平台的研究中，pSNAV/eLcH方案是表达2G12效果最佳的构建方案，转染BHK-21细胞筛选到的细胞株可以表达36.5μg/ml，具有很好的结合活性和中和活性。包装的AAV免疫SCID小鼠能够在体内持续表达48周，达到7.4μg/ml，在48周后仍维持在高水平状态，表明单次免疫即可获得持久的表达，小鼠血清纯化后也具有很好的中和活性，其TCID50是0.33μg/ml;在建立DNA载体表达中和抗体全基因基因平台的研究中，pVR/cLcH方案是表达2G12效果最佳的构建方案，瞬时转染293T细胞表达72小时可以达到5.19μg/ml，具有很好的结合活性和中和活性。通过活体基因导入仪将DNA载体免疫SCID小鼠，2周检查体内2G12的表达量达到0.55μg/ml;在建立慢病毒载体表达中和抗体基因平台的研究中，pLVX/cLcH是表达2G12效果最佳的构建方案，转染293T细胞表达72小时可以达到12.89μg/ml，具有很好的结合活性和中和活性。包装的慢病毒免疫SCID小鼠，免疫2周时体内2G12的表达量是12.44μg/ml，免疫8周时表达量可达到26.57μg/ml，之后仍能持续表达，表明单次免疫在短期内即可获得高效的表达;在建立Adv载体表达中和抗体基因平台的研究中，pDC16/eLcH是表达2G12效果最佳的构建方案，转染293T细胞表达72小时可以达到23.9μg/ml，具有很好的结合活性和中和活性。包装的重组腺病毒免疫SCID小鼠，免疫2周时体内2G12的表达量是8.92μg/ml，免疫4周时小鼠体内2G12表达最高，其表达量可达到87.39μg/ml，免疫8周后仍能持续表达，表明单次免疫在短期内也可获得高效的表达。结果证明这四种表达载体表达2G12全基因在细胞水平有很好的表达效果，而且表达的抗体都具有很高的结合活性和中和活性，同时在哺乳动物体内也能够进行高效的表达。　　通过表达保护性抗体N12-B2、N12-I2、N12-I15、N12-O2的实验研究，转染293T细胞都具有高效的表达，而且也具有很高的结合活性和中和活性，其中AAV-B2免疫SCID小鼠能够在体内持续表达48周，小鼠体内的IgG达到56.04μg/ml，免疫48周后仍能持续地表达，AAV-I15免疫SCID小鼠2周时就可以检测到I15的表达量，而且随着时间的增加I15的表达量仍在不断增加。　　综上所述，已经成功地建立了高效表达人抗体全基因的AAV载体、DNA载体、Adv载体及慢病毒载体平台，还表达了另外四种不同的HIV保护性抗体，已经验证四种载体分别表达的五种抗体具有很好的结合活性和中和活性，含抗体基因的部分载体在动物体内能够长期高效地表达。同时筛选到高效稳定表达HIV中和抗体2G12、N12-B2、N12-I2、N12-I15、N12-O2的细胞株。本研究所建立的表达人抗体全基因的四种载体平台为高效表达细胞株、基因治疗、疾病诊断等方面研究提供了良好的基础。